儿童肾盂输尿管连接部梗阻的尿液代谢组学特征与潜在诊断预后生物标志物研究

《Metabolomics》：Urinary metabolomics profile in children with ureteropelvic junction obstruction

　　

中文翻译摘要：

胎儿肾积水（HN）约在0.25%–1%的胎儿中被检出，其中肾盂输尿管连接部梗阻（UPJO）是最常见的先天性尿路畸形，也是婴幼儿及儿童肾功能衰竭的首要病因。由于该病呈现疾病谱系特点，UPJO的临床管理颇具挑战性。重度UPJO必须通过手术干预以避免肾功能损害，而非梗阻性肾积水的患儿可接受保守治疗。针对无症状患者的手术指征一直存在争议。本项初步研究旨在采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）平台，通过非靶向代谢组学方法分析UPJO患儿的尿液样本，探索能够提示肾积水谱系进展的判别性代谢物，从而为优化临床决策提供依据。研究共纳入37例患儿，在就诊时记录其临床特征，收集尿液样本并经GC-MS和HPLC-MS两个分析平台处理与检测。研究设置了三个年龄匹配（2–12岁）的组别：10例初始影像学诊断为梗阻性肾积水（OHN）的患儿、15例无症状的非梗阻性肾积水（NOHN）患儿，以及12例无任何泌尿系统问题的健康对照组（CTR）。对代谢组学数据分别采用单变量分析（包括分布检验、ANOVA、Tukey检验及Benjamini-Hochberg程序估计错误发现率）和多变量分析（偏最小二乘判别分析PLS-DA，并进行交叉验证和置换检验）。此外，利用PLS-DA排序后VIP>1的特征组合进行探索性受试者工作特征（ROC）曲线分析，以评估其判别效能。代谢组学谱图显示各组间比较存在明显的表达模式差异。对不同组间判别性代谢物的分析使得疾病在分子水平的进展过程得以清晰呈现。更重要的是，无症状患者（NOHN组）与需手术干预患者（OHN组）之间的判别具有高度临床相关性，本研究亦成功实现了这一判别。应用于GC-MS和HPLC-MS数据的所有单变量和多变量方法均表现出良好的统计学效能（单变量分析：校正后p值<0.05，q值区间0.04–0.1，AUC区间0.662–0.882；多变量分析：p值<0.03，F值区间3–11.4，R²区间0.984–0.996，Q²区间0.714–0.859，AUC区间0.923–0.995），共获得94种判别性代谢物，提示其作为诊断/预后特征具有良好的潜在临床价值。值得注意的是，胱氨酸和甲硫氨酸亚砜在OHN组与CTR组比较中表现出最大的正向倍数变化，分别为156%和152%。在全部94种判别性代谢物中，17种代谢物经单变量和多变量方法联合验证，具有特别的统计学意义。其中，1-甲基组氨酸-3-甲基组氨酸、1-甲基组胺-3-甲基组胺以及谷氨酰-羟脯氨酸（二肽）可判别NOHN组与CTR组；而扁桃酸、泛酸、糠酰甘氨酸、葡糖酸、3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、谷氨酰羟脯氨酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、核糖醇/阿拉伯醇/木糖醇（戊糖醇）及塔格糖可判别OHN组与CTR组；上述代谢物可作为诊断标志物，其中前者（NOHN vs. CTR）提示UPJO引起的初始代谢扰动，后者（OHN vs. CTR）反映UPJO对儿童代谢的长期影响。更为重要的是，抗坏血酸、糠酰甘氨酸、葡糖酸以及核糖/阿拉伯糖/木糖（戊糖）这五种代谢物已在OHN与CTR组比较中显示判别能力，并再次出现在OHN与NOHN组比较中，此外还有苏糖醇；这些代谢物可能有助于支持临床医生判断患者是否需要接受手术。代谢通路分析揭示，HN早期即可出现β-丙氨酸代谢改变，随后进展至酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸以及氨基糖/核苷酸糖代谢的进一步受损。在HN晚期，多个其他重要代谢通路亦受到损害，反映出UPJO对健康儿童基础代谢的整体影响。尽管本研究所评估队列的样本量及年龄跨度有限，但本研究通过NOHN、OHN与CTR组间比较，在94种判别性代谢物中经单变量与多变量方法联合认证了17种代谢物，其统计学质量可能有助于为探索梗阻性肾积水发生与进展的可靠生物标志物铺平道路。

论文解读：

一、研究背景与问题

胎儿肾积水（HN）在产前超声筛查中检出率约为0.25%–1%，其中肾盂输尿管连接部梗阻（UPJO）是最常见的先天性尿路畸形，在活产婴儿中的患病率约为1/1500，也是婴幼儿和儿童肾衰竭的首要病因。UPJO是一种谱系性疾病，严重梗阻必须通过手术（如Anderson-Hynes离断式肾盂成形术）以避免肾功能受损，而非梗阻性肾积水（NOHN）患儿则可行保守治疗。然而，对于无症状UPJO患者是否手术干预一直存在争议。目前临床参考标准的诊断方法（如超声、核素肾图等）对判断哪些患者需要早期手术干预的预测能力尚不理想。既往研究曾筛选多种尿液中潜在生物标志物，如视黄醇结合蛋白4（RBP-4）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子1（KIM-1）、转化生长因子β1（TGF-β1）等，但结果有限，均未进入临床实践。代谢组学可系统比较生物体内低分子量代谢产物在特定条件下的整体表达，已在多种肾脏疾病中得到应用。然而，此前尚无采用多平台非靶向代谢组学方法系统研究UPJO患儿尿液代谢谱并区分梗阻性与非梗阻性肾积水及健康对照的报道。因此，该研究旨在运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）双平台非靶向代谢组学，从尿液代谢组层面寻找能够提示肾积水谱系进展并辅助临床手术决策的判别性代谢物。

二、研究设计、方法概述与结论意义

研究人员开展了一项前瞻性观察性队列研究，研究地点为巴西圣保罗大学医学院临床医院，经当地伦理委员会批准，时间为2016年9月至2019年6月，共纳入37名儿童，并按年龄匹配分为3组：10名梗阻性肾积水（OHN）患儿、15名无症状非梗阻性肾积水（NOHN）患儿以及12名无泌尿系统疾病的健康对照（CTR）。所有患儿在门诊随访时记录临床资料并收集尿液样本。样本经处理后分别采用GC-MS和HPLC-MS（反相模式）进行非靶向代谢组学分析。统计上，研究人员运用单变量分析（ANOVA、Tukey检验、Kruskal-Wallis检验、Benjamini-Hochberg程序控制错误发现率）和多变量分析（PLS-DA，结合交叉验证与置换检验），并采用探索性ROC曲线评估判别效能。代谢物鉴定依据Metabolomics Standards Initiative（MSI）标准：GC-MS匹配NIST和Fiehn谱库（评分>80）为一级鉴定，HPLC-MS通过精确分子质量数据库检索为二级推定注释。该研究的重要结论是：共发现94种判别性代谢物，其中17种代谢物经单变量和多变量方法共同验证，GC-MS和HPLC-MS数据均显示良好的模型质量（Q²>0.71，AUC>0.92）。这些结果提示尿液代谢组学特征具有作为UPJO诊断/预后标志物的潜在临床应用价值。

三、主要关键技术与方法

1. 非靶向代谢组学双平台分析：采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS，反相色谱，正离子模式电喷雾电离）以扩大代谢物覆盖范围；2. 尿液样本前处理与质量控制：包括脲酶处理、蛋白沉淀、衍生化（甲氧胺化及硅烷化）等步骤，并设置质控（QC）样本以监测仪器稳定性；3. 多元统计建模：采用无监督主成分分析（PCA）和有监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以变量重要性投影（VIP）排序筛选判别代谢物，并进行交叉验证与置换检验控制过拟合；4. 单变量统计与ROC曲线分析：使用ANOVA/Tukey、Kruskal-Wallis/Dunn检验及Benjamini-Hochberg FDR校正，并基于PLS-DA排序特征构建ROC曲线评估判别效能；5. 代谢通路分析：基于MetaboAnalyst平台的MetPA模块进行通路富集与拓扑分析。样本队列来源为巴西圣保罗大学医学院临床医院。

四、主要研究结果

（一）多变量分析结果

研究人员对GC-MS和HPLC-MS数据分别进行PCA和PLS-DA分析。PCA中QC样本聚集于中心，表明仪器稳定性良好。PLS-DA模型结果显示：GC-MS数据中OHN vs. NOHN、OHN vs. CTR的模型R²分别为0.996和0.91，Q²分别为0.759和0.743；HPLC-MS数据中NOHN vs. CTR、OHN vs. NOHN、OHN vs. CTR的R²分别为0.988、0.985、0.984，Q²分别为0.849、0.714、0.772。置换检验（200次）证实模型未过拟合。ROC曲线分析显示，随着纳入VIP>1代谢物数量的增加，判别性能增强，AUC介于0.923–0.995之间，说明这些代谢物组合具有良好的组间区分能力。

（二）单变量分析结果

研究人员对代谢组数据进行了正态性检验（Shapiro-Wilk）、方差齐性检验（Bartlett），并采用Tukey事后检验或Kruskal-Wallis/Dunn检验进行组间差异分析，同时以Benjamini-Hochberg方法估计错误发现率。单变量分析获得了校正后p值<0.05、q值介于0.04–0.1、AUC介于0.662–0.882的判别代谢物。值得注意的是，GC-MS多变量分析未能区分NOHN vs. CTR组，但单变量分析发现了显著代谢物，说明单变量和多变量方法具有互补性。

（三）代谢物鉴定结果

在所有组间比较中共获得94种判别性代谢物。其中，胱氨酸和甲硫氨酸亚砜在OHN vs. CTR比较中展示出最大的正向倍数变化，分别为156%和152%。有17种代谢物同时经单变量和多变量分析确认。NOHN vs. CTR组比较中的判别代谢物包括1-甲基组氨酸-3-甲基组氨酸、1-甲基组胺-3-甲基组胺和谷氨酰-羟脯氨酸二肽，提示UPJO引起的初始代谢扰动；OHN vs. CTR组比较中的判别代谢物包括扁桃酸、泛酸、糠酰甘氨酸、葡糖酸、3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乙酸、谷氨酰羟脯氨酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、戊糖醇类和塔格糖，反映UPJO对儿童代谢的长期影响；更关键的是，OHN vs. NOHN组比较中，抗坏血酸、糠酰甘氨酸、葡糖酸、戊糖类以及苏糖醇具有判别能力，其中前五种也在OHN vs. CTR比较中出现，可能用于支持是否手术的临床决策。

（四）代谢通路分析结果

MetPA通路影响分析显示，NOHN vs. CTR组比较中仅β-丙氨酸代谢通路显著改变，提示疾病早期即出现轻度代谢扰动；OHN vs. NOHN组比较中，酪氨酸、苯丙氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，以及氨基糖和核苷酸糖代谢均受到显著影响，体现疾病进展；OHN vs. CTR组比较则呈现最多数目的代谢通路异常，包括其他多种重要通路，反映UPJO对患儿基础代谢的整体影响。β-丙氨酸在OHN vs. NOHN比较中显著降低（倍数变化减少36%），其衍生化合物肌肽对氧化应激具有保护作用；泛酸在NOHN vs. CTR和OHN vs. CTR中分别降低49%和59%，作为辅酶A合成前体，其减少也提示氧化应激增强。4-羟基苯乙酸在OHN vs. NOHN中倍数变化增加112%，在OHN vs. CTR中增加84%，是酪氨酸和苯丙氨酸通路的关键代谢物，其升高可能为机体对抗氧化应激的防御机制。N-乙酰-L-天冬氨酸在OHN组表达升高，与慢性肾脏疾病中的氧化应激和炎症相关。在氨基糖/核苷酸糖通路中，N-乙酰-D-甘露糖胺在OHN组降低，该物质是唾液酸的前体，其减少可能影响肾小球滤过屏障的完整性。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，鉴别OHN与NOHN组的代谢物具有重要的临床意义，因为这类代谢物可能帮助临床判断患者是否需接受手术。若某一代谢物同时出现在NOHN vs. CTR和OHN vs. NOHN比较中，则可能同时指示疾病建立与疾病进展。研究中发现的β-丙氨酸通路改变提示氧化应激随疾病进展而增强。4-羟基苯乙酸等酪氨酸/苯丙氨酸通路代谢物的变化与肾功能下降及肾小球疾病相关，但本研究结果提示其在梗阻性肾病等肾小管病变中也具有判别价值。N-乙酰-D-甘露糖胺的减少可能与唾液酸合成障碍及足细胞损伤相关。多种代谢物的变化在两个相关组间比较中方向一致，进一步支持疾病进展与这些代谢通路改变的关联。结论部分明确指出，尽管本研究为探索性研究，并非旨在直接发现疾病生物标志物，且存在样本量和年龄变异有限的局限，但通过比较NOHN、OHN与CTR组，研究人员筛选出94种尿液判别性代谢物，其中17种经单变量和多变量方法共同认证。这一工作为未来更大规模外部验证队列、靶向代谢组学分析及生物学验证研究奠定了基础，有望最终在发现的判别性代谢物中确认可靠的梗阻性肾积水生物标志物，从而优化临床决策。