穿心莲内酯抑制狂犬病病毒复制的作用及机制研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Andrographolide Inhibits Rabies Virus Replication

　　

狂犬病（rabies）是一种由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）感染引起的致命性人畜共患病。抗RABV血清或抗体是RABV感染患者的特有治疗方法。然而，在欠发达地区，由于抗RABV血清或抗体价格高昂且运输和保存成本高，患者死亡率几乎为100%。因此，迫切需要开发能够有效对抗RABV感染的新型疗法。穿心莲内酯（andrographolide, Andro）是一种从穿心莲（Andrographis paniculate）中分离得到的半日花烷型二萜内酯，数十年来一直被用于治疗细菌和病毒感染。在本研究中，研究人员发现Andro以剂量依赖性方式抑制宿主细胞中RABV的复制，其半数有效浓度（half-maximal effective concentration, EC₅₀）略低于60 μmol/L。Andro的抗病毒作用与病毒株和细胞系无关。在试管中用Andro预处理RABV 1 h不影响其在宿主细胞中的复制，提示Andro并不直接降低RABV的活力。有趣的是，Andro处理对RABV与细胞的结合或RABV入侵细胞均无影响。此外，Andro处理下调了细胞中RABV基因组RNA和结构基因的表达。为了研究Andro在体内的治疗效果，研究人员通过腹腔注射（intraperitoneal, i.p.）或灌胃（intragastric, i.g.）给予小鼠Andro。给药途径和剂量均未显著影响小鼠体重。值得注意的是，Andro保护小鼠免受RABV标准攻击株11（challenge virus standard 11, CVS-11）的致死性攻击。具体而言，i.p.注射100 mg/kg和1 mg/kg Andro将小鼠存活率分别从20%提高到60%和80%，而i.g.灌胃250 mg/kg Andro将存活率从30%提高到60%。相应地，小鼠脑组织中的RABV病毒载量也有所降低。结果表明，Andro作为新型抗RABV药物具有很大的狂犬病治疗潜力。

狂犬病是一种由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）引起的致命性人畜共患病，主要侵害温血动物的中枢神经系统。目前临床上缺乏特异性治疗药物，现有的抗RABV血清或抗体价格昂贵且依赖冷链运输，在欠发达地区可及性差，患者死亡率几乎为100%。尽管已有利巴韦林（ribavirin, RBV）、法匹拉韦（favipiravir）等候选药物被报道具有抗RABV活性，但均未获批用于临床。穿心莲内酯（andrographolide, Andro）是从穿心莲中提取的半日花烷型二萜内酯，具有广谱抗病毒、抗炎和保肝活性，已被证实可抑制HIV、登革病毒、流感病毒H1N1等多种病毒，但其对RABV的作用尚不清楚。因此，研究人员开展本研究以探究Andro对RABV复制的抑制作用及其机制，并评估其在小鼠模型中的治疗潜力。

研究人员以小鼠神经母细胞瘤（NA）细胞和仓鼠肾成纤维（BHK-21）细胞为宿主细胞，使用RABV疫苗株HEP-Flury、标准攻击株CVS-11和野生型GD-SH-01株，在细胞水平系统检测了Andro的抗病毒效果；通过超滤离心、病毒吸附与入侵实验、反转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）和Western blot分析了其作用机制；最后在KM小鼠模型中评估了Andro经腹腔注射（i.p.）或灌胃（i.g.）给药对致死性CVS-11攻击的保护效果。

主要技术方法包括：采用CCK-8法检测细胞活力并计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）；通过直接荧光抗体（direct fluorescent antibody, dFA）法进行病毒滴定，计算半数有效浓度（EC₅₀）；运用免疫荧光染色、RT-qPCR和Western blot检测病毒复制水平；利用超滤离心分离RABV与Andro以评估直接灭活作用；通过4℃吸附实验和温度转换实验分别检测病毒结合与入侵；动物实验中，KM小鼠经肌肉注射1.0×10^5.5荧光形成单位（focus-forming unit, FFU）的CVS-11攻击后2 h，分别以不同剂量Andro经i.p.或i.g.给药，监测21天存活率和脑组织病毒载量。

3.1 Andro以浓度依赖方式降低细胞活力。CCK-8实验显示，Andro处理48 h后，NA和BHK-21细胞活力随浓度升高而下降，CC₅₀分别约为74.99 μmol/L和95.94 μmol/L；10～60 μmol/L浓度范围内细胞活力无明显降低，因此后续实验采用该浓度范围。

3.2 Andro抑制NA和BHK-21细胞中RABV复制。病毒滴定结果显示，Andro对HEP-Flury、CVS-11和GD-SH-01的EC₅₀在38.57～58.7 μmol/L之间；免疫荧光显示Andro处理后RABV阳性荧光斑点显著减少；RT-qPCR显示病毒基因组RNA水平降低；Western blot显示G蛋白表达下降；病毒滴度测定证实感染性病毒粒子产量减少。以上结果共同表明Andro以剂量依赖性方式抑制RABV复制。

3.3 Andro不直接降低RABV活力。将RABV与Andro在试管中共孵育1 h后经超滤离心去除游离药物，再感染NA细胞，病毒滴度、基因组RNA水平和N蛋白免疫荧光信号均无明显变化，说明Andro并非通过直接灭活病毒颗粒发挥作用。

3.4 Andro干扰RABV与细胞结合但不影响入侵。与DMSO对照相比，60 μmol/L Andro处理使CVS-11与NA细胞结合的基因组RNA水平显著降低；但在病毒吸附后加入Andro，细胞内的病毒基因组RNA水平无显著变化，表明Andro特异性地阻断病毒吸附阶段，而对内化过程无影响。

3.5 Andro抑制细胞中RABV基因组RNA和结构基因表达。RT-qPCR检测显示，Andro处理24 h和48 h后，NA细胞内RABV基因组RNA及N、P、M、G、L五个结构基因的mRNA水平均显著低于DMSO对照组，证实Andro在转录水平抑制病毒基因表达。

3.6 Andro保护小鼠免受致死性RABV感染。在KM小鼠模型中，i.p.给予100 mg/kg和1 mg/kg Andro使存活率分别从20%提高到60%和80%；i.g.给予250 mg/kg Andro使存活率从30%提高到60%。脑组织RT-qPCR显示，i.p. 250 mg/kg和100 mg/kg显著降低脑内病毒RNA，而1 mg/kg组无显著变化；i.g. 250 mg/kg和10 mg/kg显著降低病毒RNA，但最高剂量500 mg/kg组未观察到降低。各剂量组小鼠体重无明显改变，提示Andro在该剂量范围内无明显毒性。

讨论部分指出，Andro的抗RABV机制涉及下调病毒基因组RNA和结构基因的转录，同时干扰病毒与宿主细胞的结合，而非直接灭活病毒颗粒。体内研究揭示了药物剂量与保护效果之间的复杂关系：中等或低剂量Andro可提高存活率，但高剂量反而可能无效或增加死亡率，这可能与高剂量破坏免疫稳态或影响细胞膜稳定性有关。研究强调，需要结合药代动力学和药效动力学研究确定最佳治疗窗口。Andro具有良好的安全性和血脑屏障穿透能力，作为抗RABV候选药物具有开发前景。

结论部分翻译：本研究证明Andro在细胞培养中剂量依赖性地抑制RABV复制，其机制与下调病毒基因组RNA和结构基因表达有关；动物实验显示Andro对致死性RABV感染具有保护作用。鉴于Andro耐受性好且易于获得，其有望开发为新型抗狂犬病药物。