靶向激活的AS1411适配体探针用于核仁素过表达三阴性乳腺癌的体内与离体成像

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A target-activated AS1411 aptamer probe for in vivo and ex vivo imaging of nucleolin-overexpressing triple-negative breast cancer

　　

背景：乳腺癌的荧光成像常受传统“常亮型”探针高背景信号的限制。靶向核仁素的AS1411适配体为核仁素高表达的肿瘤（包括三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC））提供了有前景的识别元件。本研究旨在开发一种靶向激活的分子探针，以实现对核仁素过表达乳腺肿瘤的高对比度检测。方法：研究人员基于AS1411适配体构建了一种可激活探针（AAFP-AS1411），通过将荧光标记的AS1411与淬灭链杂交，产生靶标响应的“关闭-开启”（OFF-to-ON）荧光响应。研究人员采用流式细胞术、荧光光谱法和共聚焦显微镜在体外评估其优先荧光响应及浓度依赖性行为。在MDA-MB-231荷瘤小鼠中评估了体内肿瘤相关荧光、离体组织荧光分布及初步急性安全性。结果：与MCF-10A细胞相比，AAFP-AS1411在MDA-MB-231 TNBC细胞中表现出低背景干扰和优先荧光激活，而序列错配或竞争性阻断后信号降低。在体内观察到优先的肿瘤相关荧光，注射后6 h检测到最强信号。离体分析显示，肿瘤组织中的荧光高于所检测的主要器官。在每只小鼠2 nmol的测试剂量和24 h时间点，基于血液学、生化和组织病理学评估未观察到明显的急性毒性。结论：AAFP-AS1411在体外、体内和离体实验中，能够在所测试的MDA-MB-231 TNBC模型中实现优先、高对比度的荧光成像。这些发现为可激活AS1411探针用于核仁素过表达TNBC分子成像的进一步评估提供了概念验证支持。

论文解读：可激活AS1411适配体探针用于三阴性乳腺癌的体内与离体成像

一、研究背景与问题

乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，包含多种分子亚型，需要个体化的诊断和治疗策略。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）以雌激素受体（estrogen receptor, ER）和孕激素受体（progesterone receptor, PR）表达缺失以及HER2无过表达或扩增为特征，通常表现出侵袭性生物学行为，且亚型特异性治疗靶点有限。TNBC约占乳腺癌的10%–20%，具有较高的早期复发和远处转移风险。因此，提高肿瘤特异性可视化的分子影像策略可能为TNBC的检测和表征提供额外价值。

荧光成像具有高灵敏度和快速信号采集的优势，在癌症检测中受到广泛关注。然而，传统“常亮型”荧光探针无论是否与靶标结合均持续发射荧光，在复杂的生物环境中可能增加背景信号并降低肿瘤与背景的对比度。可激活探针通过将分子识别与荧光恢复相耦合来解决这一局限性，从而在靶标相互作用后优先产生信号。

适配体是能够折叠成特定三维结构并以高亲和力和高特异性识别分子靶标的短单链DNA或RNA分子。AS1411是一种富含鸟嘌呤的DNA适配体，可与核仁素相互作用。核仁素是一种多功能蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中异常表达并重新分布至细胞表面。因此，AS1411已被广泛研究作为癌症成像和靶向递送的靶向配体。已有研究报道了用于癌细胞检测的可激活适配体策略，其中Zhang等人开发了一种核仁素激活的多价AS1411适配体纳米探针。然而，这些研究主要集中在细胞检测或相对复杂的多价/扩增系统，将相对简单的可激活AS1411探针转化为乳腺肿瘤的连续时间过程体内荧光成像的可行性仍未得到充分探索。

二、研究内容与结论

为解决上述空白，研究人员开发了一种基于AS1411的可激活荧光探针（AAFP-AS1411），用于核仁素过表达乳腺癌的成像。该探针被设计为在无靶标相互作用时维持低荧光（“关闭”态），从而减少背景干扰。在关闭状态下，荧光标记的AS1411链与互补淬灭链之间的杂交使荧光团与淬灭剂紧密靠近，导致荧光淬灭。当与细胞表面核仁素相互作用时，靶标相关的结构重排被认为会增加荧光团与淬灭剂之间的距离，从而恢复荧光（“开启”态）。研究通过体外结合实验、细胞成像、荷瘤小鼠多个注射后时间点的连续体内荧光成像以及离体组织荧光分布和组织成像，系统评估了AAFP-AS1411的可行性。研究人员得出结论：AAFP-AS1411在体外、体内和离体实验中均能在所测试的MDA-MB-231 TNBC模型中实现优先、高对比度的荧光成像，为可激活AS1411探针用于核仁素过表达TNBC分子成像的进一步评估提供了概念验证支持。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下主要关键技术方法：（1）可激活探针的构建：将FAM或Cy5.5标记的AS1411链与互补淬灭链按1:1.2摩尔比在磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）中杂交，经95 °C加热5 min后缓慢冷却至室温形成双链体，获得淬灭的“关闭态”探针。（2）流式细胞术分析：将细胞与250 nM探针在4 °C避光孵育30 min，使用BD FACSCanto II流式细胞仪检测荧光强度。（3）荧光光谱分析：使用Horiba Fluorolog-3荧光分光光度计记录500–650 nm发射光谱，激发波长485 nm。（4）共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）：使用Zeiss LSM 880显微镜对细胞和组织切片进行成像。（5）动物实验：使用雌性BALB/c裸鼠建立MDA-MB-231异种移植瘤模型，通过尾静脉注射2 nmol Cy5.5标记探针，使用IVIS Spectrum成像系统在注射后1、6、12 h进行活体成像，12 h后处死动物进行离体组织成像。（6）安全性评估：检测血液学参数和肝肾功能指标，并进行H&E染色组织病理学检查。

四、研究结果

靶标相关结合与荧光响应：流式细胞术和荧光光谱分析显示，AAFP-AS1411在MDA-MB-231细胞中产生的荧光强度显著高于MCF-10A细胞，表明在乳腺癌细胞模型中具有优先荧光响应。错配对照探针（AAFP-AS1411-mis）在两种细胞系中均产生极低荧光，表明完整AS1411序列对荧光响应至关重要。竞争性阻断实验进一步证实了AS1411相关选择性，过量未标记AS1411预孵育可显著降低荧光信号。

探针条件优化：通过改变互补C链长度，发现4碱基延伸在测试设计中提供最高响应。温度依赖性实验显示4 °C时荧光响应最强，但37 °C下仍保留可检测的荧光响应。浓度优化实验显示荧光强度随探针浓度增加而增加，在约250 nM处接近平台期。时间过程分析显示荧光响应在前30 min内逐渐增加，随后达到平台期。因此，250 nM探针和4 °C孵育30 min被选为后续体外实验的标准条件。

浓度依赖性荧光响应：流式细胞术和荧光光谱分析均显示AAFP-AS1411的荧光响应随MDA-MB-231细胞浓度的增加而增强。回归分析得到关系式荧光 = 214.4 × log??C – 6.981。

荧光显微镜成像：共聚焦显微镜显示，MDA-MB-231细胞与FAM-AS1411或AAFP-AS1411孵育后荧光明显强于MCF-10A细胞。错配探针仅产生弱荧光，过量未标记AS1411预阻断可显著降低MDA-MB-231细胞中的荧光信号。

体内与离体成像：在MDA-MB-231荷瘤BALB/c裸鼠中，AAFP-AS1411组在注射后1、6、12 h均观察到明显的肿瘤相关荧光，其中6 h信号最强。错配组和阻断组肿瘤荧光明显减弱。离体成像显示肿瘤组织荧光显著高于心、肺、肝、肾和脾等主要器官。定量ROI分析证实AAFP-AS1411组肿瘤荧光显著高于错配组和阻断组。离体共聚焦显微镜显示，肿瘤组织切片与Cy5.5-AAFP-AS1411孵育后产生的红色荧光明显强于正常乳腺组织切片。

安全性评估：在探针处理组与PBS对照组之间，血液学参数（WBC、RBC、HGB、PLT）和肝肾功能指标（AST、ALT、BUN、CREA）无显著差异。心、肺、肝、脾、肾的H&E染色切片未见明显治疗相关组织病理学异常。这些结果表明在所测试剂量和24 h时间点无明显的急性毒性。

五、总结讨论与研究结论

讨论部分指出，AAFP-AS1411的可激活设计使其能够在靶标相互作用前维持相对较低的荧光，从而减少背景信号。研究所观察到的错配探针荧光减弱和竞争性阻断后荧光降低，支持AS1411相关靶标参与荧光恢复过程，但并未直接证明所提出的荧光团-淬灭剂结构转变。该设计在概念上与已报道的可激活适配体、分子信标和杂交切换探针策略一致。本研究的特定贡献不在于引入可激活AS1411传感本身，而是评估了一种相对简单的荧光团-淬灭剂AS1411平台在细胞、体内和离体乳腺癌成像模型中的应用。研究结果表明，这种可激活架构能够在体内维持靶标相关荧光行为。讨论还提到荧光团的局限性，FAM易受组织自发荧光和穿透深度限制，Cy5.5虽处于NIR-I窗口但仍受组织散射影响，未来可考虑NIR-II荧光团以改善深部组织成像性能。此外，临床转化需要GMP级合成、纯化和可重复组装，以及批间质量控制和全面的药代动力学和安全性评估。研究局限性包括仅使用单一TNBC细胞系和异种移植模型、安全性评估队列较小且观察期较短、大多数体外表征在4 °C而非生理温度下进行，以及所提出的结构重排机制尚未直接验证。

研究结论：本研究开发了一种可激活的AS1411荧光探针AAFP-AS1411，该探针在体外、体内和离体实验中均能在所测试的MDA-MB-231 TNBC模型中实现优先荧光激活和高对比度成像。这些发现支持AAFP-AS1411作为核仁素过表达TNBC分子成像策略的进一步评估。需要在更多TNBC模型和患者来源标本中验证，以确定该方法在TNBC中的稳健性和转化适用性。