基于CRISPR编辑猪肝细胞构建模拟人肝癌分子与组织学特征的临床前模型

《JHEP Reports》：Modeling Liver Cancer Molecular and Histological Features by CRISPR Editing of Porcine Hepatocytes

　　

背景/目的：肝细胞癌（HCC）是一种侵袭性疾病，对现有疗法反应有限。由于缺乏能够重现人HCC并支持多模式疗法评估的临床前模型，治疗研发进展受到阻碍。本研究采用CRISPR编辑技术，鉴定驱动肝细胞转化的基因改变，并建立基因定义明确的HCC模型。 方法：从猪（n=7）中分离肝细胞，并施加2-4种基因改变的组合，包括CRISPR介导的肿瘤抑制基因（TP53、PTEN、CDKN2A、AXIN1）敲除，伴或不伴c-Myc过表达。将所得细胞皮下注射至免疫缺陷小鼠，以评估其致瘤性和组织学特征。为建立大动物模型，将自体转化肝细胞植入四个肝内位点（n=5头猪）。通过RNA测序对细胞、异种移植瘤和猪肿瘤进行转录组学分析，差异表达基因（DEG）分析采用FDR<0.05。 结果：八种基因改变组合产生了可在培养中扩增的细胞，而未修饰的原代肝细胞则不能。携带至少三种基因改变的细胞（n=5株）形成异种移植瘤（n=22只小鼠），而仅含两种基因敲除的细胞（n=5只小鼠）未形成肿瘤。携带sgTP53；c-MycOE；sgPTEN和/或sgCDKN2A的异种移植瘤重现了人肝癌的组织学特征，包括透明细胞型、梁索型、假腺型HCC和胆管癌（CCA）。转化细胞和异种移植瘤的转录组学分析显示细胞周期通路激活，并与人类HCC表达谱相似。自体转化肝细胞植入在两头猪的7/8注射位点（87.5%）生成了肝内肿瘤，为在野生型猪中建立免疫健全HCC模型提供了概念验证。 结论：本研究 delineates 了协同致癌性基因改变在体外驱动肝细胞转化的作用，并提供了重现人HCC关键组织学和分子特征的细胞及动物模型。 影响与意义：HCC对现有治疗反应率低，凸显了对转化性临床前模型的迫切需求。通过对猪肝细胞进行临床相关基因的离体CRISPR编辑，研究人员建立了重现人HCC关键分子和组织学特征的细胞及动物模型。该平台为未来机制研究、基因型-表型图谱绘制以及精准治疗的临床前测试奠定了基础。此外，猪模型的体型及与人类的生理相似性，使其成为在免疫健全环境中评估局部区域治疗和设备疗法的有前景的模型。

论文解读：基于CRISPR编辑猪肝细胞构建模拟人肝癌分子与组织学特征的临床前模型

一、研究背景与问题

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，每年导致超过83万人死亡，占原发性肝癌的85%-90%。尽管治疗手段不断进步，但不可切除HCC的现有疗法仅带来有限的生存获益，亟需更有效的治疗策略。治疗研发进展受阻的主要原因在于缺乏生理相关性高的临床前模型，难以支持HCC发生机制研究和多模式疗法评估。

HCC的发生源于基因改变的累积，肝细胞被认为是最可能的起源细胞。尽管测序研究已广泛描绘了HCC的突变图谱，但特定基因改变在恶性转化中的因果作用仍不明确。既往体外肝细胞转化研究多依赖SV40和HRAS等癌基因过表达，但SV40为实验性病毒癌蛋白，HRAS突变在人HCC中罕见，且诱导肝细胞不能完全模拟成熟肝细胞生物学特性，限制了这些系统的转化相关性。此外，小鼠模型与人类存在显著生理差异，且体型过小，不适合评估栓塞、消融等局部区域疗法（LRTs），而这类疗法用于超过半数患者。猪因其在遗传、生理、免疫和药物代谢方面与人类高度相似，成为有价值的大动物疾病模型，但现有猪肝癌模型依赖人HCC中罕见的KRAS^G12D突变，转化相关性受限。

二、研究内容与结论

为填补上述空白，研究人员采用离体CRISPR编辑猪原代肝细胞，系统评估了肿瘤抑制基因（TP53、PTEN、CDKN2A、AXIN1）敲除及c-Myc过表达的不同组合对肝细胞转化的驱动作用。研究发现，至少三种基因改变组合能够驱动肝细胞体外转化并形成可扩增细胞系，而仅两种基因敲除不足以实现转化。将携带三种或四种基因改变的细胞皮下注射至SCID小鼠后，成功形成了重现人肝癌关键组织学特征的异种移植瘤，包括透明细胞型、梁索型、假腺型HCC及胆管癌（CCA）表型。转录组分析显示这些肿瘤激活了细胞周期和DNA复制通路，并与人类HCC分子亚型（Hoshida S1/S2/S3）具有相似性。进一步通过自体肝内植入转化肝细胞，在免疫健全的野生型猪中成功建立了肝内肿瘤模型，在7/8注射位点（87.5%）形成肿瘤，为评估LRTs和免疫治疗提供了临床相关的大动物平台。

三、关键技术方法

研究人员从7头雄性Yucatan小型猪中分离原代肝细胞，通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物转染实现TP53、PTEN、CDKN2A和AXIN1的基因敲除，并通过慢病毒载体转导实现c-Myc过表达。经2-4周培养自然选择后建立可扩增细胞系。将细胞皮下注射至SCID小鼠（NOD.CB17-Prkdc^scid/J）评估致瘤性，并将自体转化肝细胞在超声引导下植入猪肝内四个位点（n=5头猪），使用明胶海绵、合成水凝胶或Matrigel等支架材料，部分猪接受围注射期口服糖皮质激素。通过RNA测序（RNA-seq）对细胞、异种移植瘤和猪肝内肿瘤进行转录组分析，使用STAR比对至猪参考基因组（Sscrofa11.1），RSEM定量表达，DEBrowser进行差异表达基因（DEG）分析，Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路分析，并采用最近模板预测（NTP）算法判定Hoshida HCC分子亚型。

四、研究结果

CRISPR诱导的基因改变在原代猪肝细胞中产生可扩增细胞群

研究人员基于人HCC突变图谱及共突变模式，选择TP53、PTEN、CDKN2A、AXIN1四个肿瘤抑制基因和c-Myc癌基因，通过CRISPR/Cas9敲除和慢病毒介导的c-Myc过表达，对猪原代肝细胞施加2-4种基因改变组合。未修饰的对照肝细胞不能在培养中扩增，而八种基因改变组合产生了可连续传代的细胞系。测序确认所有靶基因均检测到CRISPR介导的插入缺失（indels），且在连续传代过程中携带肿瘤抑制基因indels的细胞比例富集，表明这些改变协同赋予细胞选择性生长优势。Western blotting确认了c-Myc过表达和PTEN蛋白表达降低。不同基因型的细胞增殖速率存在差异，TPKM和TPM细胞增殖最快，仅含两种改变的细胞呈扁平形态且倍增时间显著延长。

突变组合在体内赋予临床相关的肝癌表型

将细胞系皮下注射至SCID小鼠后，携带三种或四种基因改变的细胞系（TPKM、TPM、TKM、TPK、TXM）一致形成实体肿瘤，而仅含两种改变的细胞系（TP、TK、PK）在6个月内未形成肿瘤。组织病理学分析显示，TPKM、TPM和TKM来源的肿瘤为多表型上皮性肿瘤，分化差至中等，重现了人肝癌特征，包括透明细胞型HCC、梁索型HCC、假腺型HCC和胆管癌（CCA）等结构模式。HCC区域Arginase阳性、CK19阴性，而CCA区域呈相反染色模式。TPK肿瘤缺乏典型HCC或CCA形态，TXM肿瘤类似粗梁索型HCC。这些结果证明c-Myc与TP53、PTEN和CDKN2A协同驱动肝细胞恶性转化。

克隆性肝癌细胞模拟HCC组织学亚型特征

为降低混合细胞群的异质性，研究人员从TPKM和TKM细胞池中分离单细胞克隆。七个TPKM克隆均确认携带TP53、PTEN、CDKN2A的CRISPR诱导indels及c-Myc整合，倍增时间为13.7-19.6小时。注射至SCID小鼠后，各克隆形成异质性较低的肿瘤，呈现不同组织学表型：克隆C2形成致密型HCC，克隆C5形成梁索型HCC，克隆C6显示HCC伴鳞状分化，克隆C4类似CCA伴鳞状分化，克隆C3显示HCC肉瘤样变异，克隆C7形成CCA、肉瘤样梭形细胞和HCC混合表型，克隆C10类似CCA或CK19阳性HCC。TKM克隆（K10、K11、K12）均形成肿瘤，但组织学表型各异。这些克隆模型为研究基因型-组织型关联提供了平台。

转录组分析揭示猪肝癌细胞模型中细胞周期通路激活

RNA测序比较显示，建立的细胞系与对照肝细胞在PCA和聚类分析中明显分离，TPK和PK细胞（非HCC肿瘤或未成瘤）与致瘤细胞分开。TPKM、TPM和TKM细胞的DEG分析及通路分析显示细胞周期和细胞外基质（ECM）重塑通路激活，上调基因包括关键细胞周期调控因子（AURKA、AURKB、CCNB1、CCNA2、BUB1、PLK1）及ECM重塑基因，甲胎蛋白（AFP）在TPKM和TKM细胞中高表达。下调基因富集于正常肝功能相关通路，包括肝转录因子（FOXA3、CEBPD）、Wnt通路基因和药物代谢基因（CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1）。与人HCC数据集比较，细胞周期和Aurora B等通路在三个细胞模型中均被激活，且多个与人HCC预后不良相关的基因（BUB1B、CDC20、CDCA5、MCM6、MCM3、TARBP1、TOP2A）表达升高。

猪肝癌异种移植瘤重现人HCC转录特征

异种移植瘤的RNA测序显示与相应细胞系一致的通路改变。PCA和聚类分析表明TPKM、TPM、TKM和TXM肿瘤与正常猪肝明显分离。DEG和通路分析鉴定出细胞周期和DNA复制相关基因上调，包括CDK1、CCNA2、CCNB1、CCNB2、AURKA、AURKB、BUB1、CDC20及MCM家族基因，AFP在TPKM和TKM肿瘤中上调。正常肝功能相关通路（外源物代谢、胆固醇和胆汁酸代谢、氨基酸加工）下调。与人HCC比较，多个与不良生存相关的基因（KPNA2、CDK1、MCM3、MCM6、PRC1、FEN1、NT5DC2、LRRC1）在异种移植瘤中上调，且过表达此前验证的9基因HCC进展/预后签名（ANLN、BIRC5、BUB1B、CDC20、CDCA5、CDK1、NCAPG、NEK2、TOP2A）。Hoshida S1/S2/S3亚型在异种移植瘤中均有代表，支持其临床相关性。

通过自体细胞原位植入建立猪HCC模型

为建立大动物HCC模型，研究人员将自体转化肝细胞注入猪肝内。首次尝试（每部位1500万细胞）在4个月监测期内未检测到肿瘤。后续实验（猪3和4）改用TPKM细胞、增加细胞数（每部位7000万和5500万）并给予围注射期口服糖皮质激素，使用明胶海绵或合成水凝胶作为支架，在2-3周内于7/8注射位点（87.5%）形成肝内肿瘤，肿瘤大小为0.8-3.7厘米（中位1.9厘米），适合LRTs测试。明胶海绵位点肿瘤大于水凝胶位点肿瘤。组织学显示肿瘤含Arginase阳性结节，围绕中央钙化或坏死区域，伴有纤维化和以淋巴细胞为主的致密炎性浸润，核c-Myc和Ki67阳性，CK19阴性排除CCA。猪6和7使用Matrigel或VitroGel? RGD支架、每部位3000万细胞，未检测到肿瘤，提示植入条件影响成功率。猪3的四个肿瘤转录组分析显示，明胶海绵位点肿瘤与正常肝分离明显，DEG数量多（5748个），激活癌症和免疫通路（Th1通路、TCR信号、吞噬体形成、白细胞外渗），下调正常肝功能通路，符合Hoshida S1亚型；水凝胶位点肿瘤DEG少（453个），因样本含大量正常肝组织，归为S3亚型。MCP-counter分析显示肿瘤中T细胞、CD8 T细胞、细胞毒性淋巴细胞、B系细胞、单核系细胞、髓系树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞丰度增加，并富集免疫激活标志物（CD8A、GZMA、PRF1）、免疫检查点基因（PDCD1、CTLA4、LAG3）和基质/TGF-β相关基因（TGFB1、COL1A1、POSTN），提示免疫浸润性肿瘤微环境伴免疫耗竭和基质激活特征。

五、讨论与结论

该研究通过离体CRISPR编辑猪肝细胞，揭示了驱动肝细胞转化的协同致癌改变，建立了基因定义明确的肝癌细胞和动物模型。与小鼠细胞通常两种改变即可转化不同，猪肝细胞需要至少三种基因改变，反映了猪作为严格且转化相关模型系统的价值。c-Myc在猪肝癌发生中发挥关键协同作用，与TP53、PTEN、CDKN2A改变共同驱动恶性转化，这与人类HCC和基因工程小鼠模型的观察一致。自体原位植入策略规避了转基因猪的高成本和长周期，同时允许引入定制基因改变，相比兔VX2模型（鳞状癌）和化学诱导猪肿瘤（无法精确遗传操作），具有更高的生物学和转化相关性。研究局限性包括CRISPR编辑产生异质indels可能不完全导致功能丧失、缺乏猪蛋白交叉反应抗体验证蛋白水平改变、部分基因型评估小鼠数量有限、克隆系数量有限、自体细胞制备耗时导致队列规模小、仅使用雄性猪且无肝硬化背景等。未来研究方向包括纳入肝硬化、扩大猪队列、纳入两性、更全面的免疫分析、验证蛋白水平改变，以及开发携带CTNNB1激活突变等替代驱动改变的模型。研究结论为：通过组合患者肿瘤中常见的基因改变，研究人员建立了重现人HCC关键特征的细胞、异种移植瘤和猪模型，该平台有望加速HCC精准治疗（包括局部区域和全身疗法）的开发。