低饲料剂量-幼虫密度比削弱黑水虻幼虫生物转化中的病原体灭活效果

《Frontiers in Microbiology》：Low feed dose-to-larval density attenuates pathogen inactivation in black soldier fly larvae bioconversion

　　

黑水虻（Hermetia illucens）幼虫（BSFL）可将生物废弃物底物转化为高价值产品，并在生物转化过程中减少众所周知的食源性病原体。底物性质、饲料剂量和幼虫密度是影响工艺效率的关键因素，然而它们对病原体削减的影响尚不清楚。研究人员在实验室规模试验中针对这一空白进行了研究，将BSFL饲养在不同幼虫密度（0、1、3和6 幼虫 cm^–2）下，并相应提供0.6、0.2和0.1 g VS larva^–1的饲料剂量。由此得到经幼虫密度和面积校正的饲料剂量，即饲料剂量-幼虫密度比，分别为2.6、0.9和0.4 mg VS larva^–1 cm^–2。研究人员以富含碳水化合物或富含蛋白质的底物饲喂BSFL，并在三次投喂事件中投加底物。病原体灭活效果通过评估接种了细菌病原体混合物（沙门氏菌属Salmonella spp. 和大肠杆菌Escherichia coli）的底物来确定，接种方式为仅在第一次投喂时接种（单次接种），或在全部三次投喂时接种（多次接种）。低饲料剂量-幼虫密度比提高了生物转化效率、幼虫产量和底物削减率，但降低了幼虫存活率、最终幼虫体重和虫砂产量。富含碳水化合物的底物比富含蛋白质的底物具有更高的生物转化效率和底物削减率。相反，富含蛋白质的底物比富含碳水化合物的底物具有更高的病原体削减率（Δlog₁₀Red）。出乎意料的是，Δlog₁₀ Red随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降，且多次底物接种比单次底物接种导致更大的下降幅度。总的来说，研究结果表明工艺效率与病原体灭活密不可分：低饲料剂量-幼虫密度比可提高工艺效率，但可能损害工艺和产品的微生物卫生安全。这一权衡突显了在BSFL生物转化中对工艺效率和卫生安全进行综合优化的必要性。

论文解读

1. 研究背景与问题

黑水虻（Hermetia illucens）幼虫（BSFL）是一种全变态昆虫，其幼虫阶段具有多食性和腐食性，能够利用多种生物废弃物，包括农业工业副产物、屠宰场废弃物、餐厨垃圾和粪便等。在生物转化过程中，BSFL将底物中的营养物质转化为两种高价值产品：富含营养的幼虫生物质（可用于饲料配方）和处理残留物虫砂（主要用作生物肥料）。因此，BSFL生物转化被认为是一种新兴的废弃物处理技术，具有推动循环经济和“一体化健康”等全球可持续发展倡议的潜力。BSFL生物转化的一个关键益处是能够灭活或减少底物中存在的食源性病原体，如大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。病原体灭活对于生物转化过程和产品的卫生安全至关重要，但其机制仍不清楚。

食源性病原体引起的疾病，如致病性大肠杆菌和沙门氏菌，仍然是全球主要的公共卫生问题和经济负担。例如，伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）是人类限制性病原体，每年导致约930万例伤寒和超过10万人死亡；而都柏林沙门氏菌（S. Dublin）则适应牛宿主，可导致犊牛高死亡率。大肠杆菌（所有致病变型合计）在2019年与约95万人死亡相关，在五大细菌病原体中排名第二。

已有研究表明，BSFL处理人类粪便可在8天内实现鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）6 log₁₀的削减；在连续系统中，2周内可将底物中约7 log₁₀的鼠伤寒沙门氏菌减少至虫砂中约4 log₁₀，7周后低于检测限。病原体削减与影响工艺效率的因素密切相关。例如，将底物分为三次投喂可提高工艺效率并减少沙门氏菌和大肠杆菌，且当底物仅在第一次投喂时接种病原体时，病原体削减更为显著。底物类型也会影响病原体灭活：BSFL处理鸡粪可加速肠炎沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的削减，但在牛粪或猪粪中未观察到病原体削减。这些不一致的结果部分归因于所用菌株的差异，但其他因素也可能影响病原体灭活。

工艺效率通过生物转化效率、幼虫产量、幼虫存活率和底物削减率等参数评估。幼虫密度是另一个影响工艺效率的因素。一般而言，高幼虫密度与个体最终幼虫体重和体型减小相关，无论底物类型如何。高幼虫密度还会上调BSFL的免疫反应，例如提高酚氧化酶活性；高种群密度可触发组成性免疫防御的上调，包括抗菌肽（AMPs）的分泌，这种现象称为密度依赖性预防。组成性免疫反应在营养和能量上代价高昂。膳食蛋白质对组成性免疫反应和病原体抗性的影响强于膳食碳水化合物；转录组分析发现，在富含蛋白质的底物上饲养的BSFL中编码AMPs的基因表达更高。AMPs的生物合成部分与生物转化过程中的病原体灭活有关，促进AMP生物合成的条件可能增强病原体灭活。

然而，底物的大营养素（如蛋白质和碳水化合物）组成和幼虫密度对病原体削减的影响尚不清楚。研究人员因此假设，高幼虫密度配合递减的饲料剂量（即低饲料剂量-幼虫密度比）会促进病原体灭活，特别是在富含蛋白质的底物中，因为膳食蛋白质支持幼虫的组成性免疫反应和生长。本研究的具体目标是评估饲料剂量-幼虫密度比和底物类型（富含蛋白质和富含碳水化合物）对（i）工艺效率和（ii）单次和多次底物接种下细菌病原体（沙门氏菌和大肠杆菌）动态及灭活的影响。

2. 研究开展与主要结论

研究人员在实验室规模试验中，使用不同的幼虫密度（0、1、3和6 幼虫 cm^–2）饲养BSFL，对应的饲料剂量分别为0.6、0.2和0.1 g VS larva^–1，由此得到饲料剂量-幼虫密度比为2.6、0.9和0.4 mg VS larva^–1 cm^–2。BSFL被饲喂富含碳水化合物或富含蛋白质的底物，分三次投喂。病原体灭活试验在底物中接种细菌病原体混合物（沙门氏菌属和大肠杆菌），接种方式为仅在第一次投喂时接种（单次接种）或在全部三次投喂时接种（多次接种）。

研究得出以下主要结论：低饲料剂量-幼虫密度比提高了生物转化效率、幼虫产量和底物削减率，但降低了幼虫存活率、最终幼虫体重和虫砂产量。富含碳水化合物的底物比富含蛋白质的底物具有更高的生物转化效率和底物削减率。相反，富含蛋白质的底物比富含碳水化合物的底物具有更高的病原体削减率（Δlog₁₀Red）。出乎意料的是，病原体削减率随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降，且多次底物接种比单次底物接种导致更大的下降幅度。总的来说，工艺效率与病原体灭活密不可分：低饲料剂量-幼虫密度比可提高工艺效率，但可能损害工艺和产品的微生物卫生安全。

3. 主要关键技术方法

本研究采用了以下关键技术方法：（1）实验室规模生物转化试验：在231 cm²的深色塑料容器中进行，设置不同幼虫密度和两种底物类型（碳水化合物丰富型和蛋白质丰富型），底物分三次投喂；样本来自瑞典农业科学大学（SLU）自2015年建立的BSFL种群。（2）病原体动态与灭活评估：在生物安全二级实验室中进行，底物接种六种细菌菌株（两株大肠杆菌和四种沙门氏菌血清型），采用选择性培养基（Chromocult琼脂和大肠杆菌XLD琼脂）对病原体进行定量枚举，并计算灭活速率常数（k）、十进制削减时间（D₉₀）和总对数病原体削减率（Δlog₁₀Red）。（3）理化分析：测定底物、幼虫和虫砂的总固体（TS）、挥发性固体（VS）、pH、氨基酸组成和近端成分；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）靶向分析虫砂和脂肪组织中的抗菌肽（AMPs）。（4）统计分析与可视化：使用R软件（v.4.4.2）进行，采用方差分析（ANOVA）、Tukey HSD检验、Scheirer-Ray-Hare检验和Dunn检验等。

4. 研究结果

（1）底物理化性质：除无氮浸出物（NFE）外，富含蛋白质底物的大多数理化性质是富含碳水化合物底物的2至3倍。富含蛋白质底物的粗蛋白含量为干物质（DM）的32%，而富含碳水化合物底物为15%；NFE则相反，分别为32%和68%。两种底物的水分含量分别为74%和76%，pH、干物质含量、VS和灰分相似。

（2）实验1：工艺效率。生物转化效率随饲料剂量-幼虫密度比的降低而显著增加（F_2,66 = 124.5, P < 0.001），且在富含碳水化合物的底物中高于富含蛋白质的底物（F_1,66 = 15.1, P < 0.001）。幼虫产量随饲料剂量-幼虫密度比的降低而显著增加（F_2,66 = 387.7, P < 0.001），但底物类型之间无显著差异。幼虫存活率随饲料剂量-幼虫密度比的降低而显著下降（F_2,66 = 6.0, P < 0.001），但在所有处理中均超过80%。最终幼虫体重随饲料剂量-幼虫密度比的降低而显著下降（F_2,66 = 281.7, P < 0.001），在最高饲料剂量-幼虫密度比时为约256.6 mg larva^–1（碳水化合物底物），在最低时为约102.1 mg larva^–1。底物削减率随饲料剂量-幼虫密度比的降低而显著增加（F_2,66 = 57.9, P < 0.001），且在碳水化合物底物中更高；虫砂产量随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降，且在蛋白质底物中更高。

（3）实验2：单次底物接种。病原体削减从第3天开始，持续至第14天。沙门氏菌的Δlog₁₀ Red受饲料剂量-幼虫密度比（F_3,112 = 373.6, P < 0.001）和底物类型（F_1,112 = 963.2, P < 0.001）的显著影响。在富含蛋白质的底物中，2.6和0.9 mg VS larva^–1 cm^–2时沙门氏菌的Δlog₁₀ Red为5.1，在0.4 mg VS larva^–1 cm^–2时降至4.5，而对照组为1.5。在富含碳水化合物的底物中，Δlog₁₀ Red为1.7、2.9和2.9，对照为1.8。大肠杆菌的Δlog₁₀ Red同样受饲料剂量-幼虫密度比和底物类型的显著影响（P < 0.001），在富含蛋白质底物中最高为4.6（2.6 mg VS larva^–1 cm^–2），降至0.9和0.4时分别为2.4和2.3；碳水化合物底物中为2.2、2.7和2.5，对照为2.7。总体而言，病原体削减在富含蛋白质的底物中更高，但随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降。

（4）实验3：多次底物接种。与单次接种类似，病原体削减随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降，尤其是在富含蛋白质的底物中。但多次接种的整体病原体削减低于单次接种。在0.9和0.4 mg VS larva^–1 cm^–2的富含蛋白质底物处理中，沙门氏菌未观察到削减，因此这些数据未进行统计检验。结果表明，病原体灭活强烈依赖于病原体接种频率；多次接种可能产生追加接种效应，导致病原体负载累积，从而限制削减效果。

5. 讨论与结论总结

讨论部分指出，低饲料剂量-幼虫密度比提高生物转化效率的机制可能涉及补偿性摄食或代谢增强。BSFL在低蛋白（碳水化合物丰富）底物上会调整食物摄入、酶产生和吸收以满足营养需求。底物削减的增加也归因于幼虫活动和相关微生物群落的活动。最终幼虫体重的下降可能源于高密度下资源竞争、代谢废物积累以及底物温度升高导致的逆温度尺寸效应。

关于病原体灭活，富含蛋白质底物中更高的病原体削减可能与膳食蛋白质支持BSFL免疫反应（如AMP生物合成）有关。研究人员在预试验中通过LC-MS/MS在BSFL脂肪组织中检测到抗菌肽（如攻击素），但未在虫砂中检测到，无法建立底物组成、AMP产生和病原体灭活之间的直接联系。此外，低饲料剂量-幼虫密度比可能限制幼虫的免疫能力，从而削弱AMP介导的病原体灭活。多次接种导致的低病原体削减归因于病原体负载的持续投入，而单次接种则允许幼虫和底物微生物群落逐步削减病原体。

研究结论指出，BSFL生物转化中的工艺效率和病原体灭活密不可分。幼虫密度和饲料剂量的效应内在相关：在不调整饲料剂量的情况下增加幼虫密度会改变每只幼虫的饲料剂量。为此，研究人员引入了新参数“饲料剂量-幼虫密度比”，用以表示经密度和面积校正的饲料剂量。就工艺效率而言，生物转化效率、幼虫产量和底物削减率随饲料剂量-幼虫密度比的降低而增加；而幼虫存活率、最终幼虫体重和虫砂产量随其降低而下降。相反，病原体削减随饲料剂量-幼虫密度比的降低而下降，但在富含蛋白质的底物中高于富含碳水化合物的底物。此外，与单次接种相比，多次底物接种时的病原体削减有限或缺失。因此，低饲料剂量-幼虫密度比可增强某些工艺效率参数，但可能损害工艺和产品的微生物卫生安全。这凸显了对BSFL生物转化中工艺效率和微生物卫生进行综合优化的必要性。