南极假单胞菌/水假单胞菌（Pseudomonas/Aquipseudomonas）菌株对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的冷活性抗真菌作用：基因组与表型特征解析

《Frontiers in Microbiology》：Genomic and phenotypic characterization of Antarctic Pseudomonas/Aquipseudomonas sp. strains with cold-active antifungal activity against Botrytis cinerea

　　

摘要专业翻译 灰霉病由嗜冷性坏死营养型真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起，是采后损失的首要原因，而对该病的防控正日益受到杀菌剂抗性田间种群扩散及传统生物防治剂在冷链温度下失效的双重制约。南极土壤是冷活性拮抗菌的合理但尚未充分开发的来源。本研究从南极乔治王岛南极发草（Deschampsia antarctica）根际土壤中分离可培养细菌，并在22 °C和0 °C下针对灰葡萄孢（B. cinerea）进行筛选。在57株细菌分离物中，44株在22 °C下表现拮抗活性，但仅28株在0 °C下保留活性。5株具有无法区分的rep-PCR指纹图谱的假单胞菌属（Pseudomonas）分离物（荧光假单胞菌群，P. fluorescens group）在低温下对菌丝生长的抑制率≥70%，且对苯氧菌胺（fenhexamid）抗性菌株及多药抗性菌株同样有效，而中温参考菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在0 °C下完全丧失活性。代表性菌株AN3A02的多相及基于基因组的表征将其归入近期提出的水假单胞菌属（Aquipseudomonas）（GTDB-Tk），并鉴定为推定新种（与最近模式菌株P. yamanorum的ANI为94.89%，dDDH为57.9%）。基因组挖掘预测了10个生物合成基因簇（BGCs），与脂肽、高亲和力铁载体及挥发性化合物相结合的多因子拮抗机制一致。在无接触实验中，AN3A02的挥发性物质在0 °C下抑制菌丝生长及抗性结构和繁殖结构的形成，并在模拟冷链条件下接种的蓝莓和鲜食葡萄上，将灰霉病发病率降低至低于SO?释放剂所达到的水平。这些冷适应南极假单胞菌/水假单胞菌（Pseudomonas/Aquipseudomonas）菌株是沿水果冷链对杀菌剂抗性灰霉病进行生物防治的有前景的候选菌株。

论文解读

一、研究背景与问题

灰霉病由嗜冷性坏死营养型真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起，是一种分布广泛、寄主范围极广的植物病原真菌，至少影响240种作物，包括葡萄、番茄和浆果类水果。该病原菌在作物生长期间及采后贮藏和运输过程中均可发病，对智利等南半球鲜果出口大国造成严重经济损失。在智利，田间损失达15–40%，采后损失高达30%。

传统防控策略依赖采前合成杀菌剂，包括二甲酰亚胺类、苯基吡咯类、苯胺基嘧啶类、羟基苯胺类、羧酰胺类、甲氧基丙烯酸酯类和三唑类等。然而，超过50年的持续使用已导致灰葡萄孢对15类系统性及保护性杀菌剂产生抗性，多药抗性田间种群已广泛建立。与此同时，农产品中农药残留面临日益严格的限量标准，种植者缺乏有效的化学替代方案。

生物防治被视为最有前景的替代策略之一。然而，现有商品化生物防治制剂（如基于枯草芽孢杆菌的产品）主要针对采前使用，在冷链温度下失去效力，而抗性灰葡萄孢田间分离株在4 °C以下仍可正常生长。因此，在0 °C下有效控制灰霉病、同时对消费者和环境安全的方案仍是未满足的需求。

南极土壤是冷活性拮抗菌的合理来源。南极大陆约99%的极端环境微生物物种尚未被培养，是新型抗菌化合物的潜在宝库。南极土壤细菌已展现出多种应用价值，但关于南极细菌产生抗真菌代谢产物的报道仍然稀少。尽管近期已有研究对一株南极假单胞菌分离物的挥发性组分进行了化学表征并证明其对蓝莓上灰葡萄孢的抑制作用，但这些分离物的分类学身份、拮抗作用的基因组基础以及冷活性抗药性菌株活性的共享程度仍未得到充分探索。

二、研究内容与结论

本研究从南极发草（Deschampsia antarctica）根际土壤中分离可培养细菌，并在22 °C和0 °C下针对灰葡萄孢进行双重培养拮抗筛选。在57株细菌分离物中，44株在22 °C下表现拮抗，但仅28株在0 °C下保留活性。5株具有不可区分rep-PCR指纹图谱的假单胞菌属分离物在低温下抑制菌丝生长≥70%，且对苯氧菌胺抗性菌株和多药抗性菌株同样有效，而中温参考菌株枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在0 °C下完全丧失活性。代表性菌株AN3A02经多相及基因组表征被归入水假单胞菌属（Aquipseudomonas），鉴定为推定新种。基因组挖掘预测10个生物合成基因簇，与多因子拮抗机制一致。无接触实验证明AN3A02挥发性物质在0 °C下抑制菌丝生长及抗性结构形成，并在模拟冷链条件下显著降低蓝莓和鲜食葡萄的灰霉病发病率，效果优于SO?释放剂。

三、主要关键技术方法

研究人员从南极乔治王岛波兰Arctowski研究站周边三个采样点采集南极发草根际土壤（深度不超过10 cm），采用直接平板涂布、系列稀释涂布及80 °C热处理孢子富集法分离可培养细菌。针对灰葡萄孢参考菌株B05.10、苯氧菌胺抗性菌株7ac和多药抗性菌株PN2进行双重培养拮抗实验。采用16S rDNA扩增测序、多位点序列分析（MLSA）和rep-PCR（REP、ERIC、BOX-PCR）基因分型进行分子鉴定。利用GTDB-Tk v2.7.2进行系统发育基因组学分析，pyani-plus计算平均核苷酸一致性（ANI），Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0进行电子DNA-DNA杂交（dDDH）。antiSMASH v8.0.4进行次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）挖掘。采用密封双室培养皿进行挥发性介导拮抗实验，并在蓝莓和鲜食葡萄上进行模拟冷链采后保护实验。

四、研究结果

3.1 分离与体外拮抗活性筛选：从南极发草根际土壤共获得76株可培养微生物分离物，其中57株经革兰氏染色和16S rDNA确认为细菌。44株在22 °C下表现拮抗，28株（63.6%）在0 °C下同时抑制病原菌。5株分离物（AN2B06、AN2B07、AN3A02、AN3A05、AN3B23）在低温下抑制率≥70%，被选为进一步研究对象。

3.2 对抗杀菌剂抗性灰葡萄孢菌株的拮抗作用：5株分离物在22 °C和0 °C下对抗性菌株（7ac和PN2）的抑制程度与对敏感参考菌株B05.10相当，表明其拮抗作用与这些菌株所抗杀菌剂的作用靶点无关。相比之下，中温参考拮抗菌枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在22 °C下抑制约55%，但在0 °C下无检测到抑制活性。

3.3 16S rDNA分子鉴定与系统发育：5株分离物的16S rDNA序列与亚南极环境分离的P. yamanorum 8H1?共享≥98.58%一致性，系统发育树中与P. yamanorum及P. gessardii亚群成员聚为一组。

3.4 rep-PCR基因分型：REP、ERIC和BOX-PCR三种引物组合在5株分离物中产生完全一致的指纹图谱，表明它们构成克隆或近克隆种群，因此选择单一代表菌株AN3A02进行全基因组表征。

3.5 表型特征与细胞形态：5株分离物为短直、革兰氏阴性、不产孢、运动性杆菌，生长温度范围0–30 °C，耐受4% NaCl，在King培养基上紫外光下产生荧光。代表菌株AN3A02具有单极鞭毛，尺寸为0.9–1.2 μm宽×1.9–2.8 μm长。所有分离物在血琼脂上产生β溶血，CAS实验阳性表明产铁载体。

3.6 AN3A02的系统发育基因组学与物种边界界定：GTDB-Tk分析成功鉴定118个细菌标记基因，系统发育基因组学将AN3A02置于水假单胞菌属（Aquipseudomonas）内，与Pseudomonas sp. ATCC PTA-122608形成紧密单系分支。ANI分析显示AN3A02与ATCC PTA-122608的ANI为98.92%，超过物种边界阈值；与最近有效命名参考种P. yamanorum LMG 27247的ANI为94.89%，处于物种界定边界。dDDH分析显示AN3A02与P. yamanorum LMG 27247的dDDH值为57.9%，远低于70%的物种共特异性阈值。综合结果表明AN3A02代表推定新种。

3.7 次级代谢产物生物合成潜力：antiSMASH预测AN3A02基因组含有10个生物合成基因簇（BGCs），包括两个NRPS簇（其中Region 16.1与tolaasin I/F生物合成簇具中等相似性）、两个铁载体相关簇（pyoverdine SXM-1和Pf-5 pyoverdine）、两个氢氰酸簇、一个NAGGN类渗透保护簇和一个芳基多烯簇等。这些预测与体外观察到的多因子拮抗特征一致。

3.8 挥发性介导的拮抗作用：在密封双室培养皿中，AN3A02挥发性物质显著减少灰葡萄孢菌丝生长，并在40天0 °C长期培养中抑制菌核、分生孢子梗和分生孢子的形成。在模拟冷链条件下，蓝莓上多药抗性菌株PN2引起的腐烂发病率从 untreated control 的51.7%降至1.7%，而SO?释放剂组为66.7%；鲜食葡萄上发病率从100%降至30.0%，均显著优于SO?释放剂。

五、讨论与结论

讨论部分指出，筛选设计本身具有重要信息价值：44株在22 °C下拮抗但仅28株在0 °C下保留活性，且菌株排名在两个温度条件下仅部分一致，表明传统中温筛选会低估冷活性菌株的价值。中温参考菌株在0 °C下完全失活，再现了商品化芽孢杆菌制剂在冷链温度下失效的报道现象。

5株分离物与P. yamanorum 8H1?共享高16S rRNA一致性，该物种所有已知菌株均分离自寒冷土壤，与分离物的嗜冷表型一致。表型比较显示，分离物生长范围延伸至0 °C而失去中温范围上端，与基因组指数共同支持其新种地位。rep-PCR一致指纹图谱与南极土壤低多样性和强扩散组分特征一致。

基因组分析提供了拮抗作用的机制基础：两个pyoverdine样铁载体途径支持高亲和力铁获取策略；tolaasin样NRPS簇提供直接的菌丝生长抑制分子机制；挥发性化合物在0 °C下持续释放，是冷活性表型的最可能效应因子。先前研究已通过GC-MS解析了AN3A02的45种挥发性化合物，其中二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、2-壬酮、1-辛醇和甲硫醇等具有文献记载的抗真菌活性，且在0 °C贮藏期间持续释放。HCN未从头空间回收，因此不是主要效应因子。

研究局限性包括：果实实验仅在实验室规模进行，需商业包装和贮藏条件下的验证；双室设计未鉴定具体挥发性效应化合物；β溶血活性提示需进行正式生物安全评估，包括溶血活性表征、抗生素抗性谱和细胞毒性/致病性测试。

结论部分翻译：南极维管植物发草的根际土壤产生了在采后贮藏相关温度下对灰葡萄孢具有显著抗真菌活性的可培养细菌。5株rep-PCR不可区分的假单胞菌分离物在0–2 °C下抑制菌丝生长≥70%，且对抗杀菌剂和多药抗性菌株同样有效。代表菌株AN3A02的多相和基于基因组的表征将其置于P. gessardii亚群内，为推定新种，并揭示了与其拮抗作用一致的次级代谢产物生物合成潜力。实验进一步表明挥发性化合物在0 °C下保持活性的贡献：在无接触系统中，该分离物与灰葡萄孢体外抗性和繁殖结构形成减少相关，在接种的蓝莓和鲜食葡萄上，其挥发性物质在模拟冷链贮藏下与较低的灰霉病发病率相关，效果优于作为采后标准的SO?释放剂。这些冷适应南极假单胞菌菌株可能代表沿水果冷链对灰霉病进行生物防治的有前景的候选菌株。鉴定所涉及的挥发性物质并确定其相对贡献，以及在更大规模和商业条件下的验证，以及新种的正式分类学描述，将是这些菌株开发为生物防治产品之前所需的步骤。