油菜茎秆溃疡病菌Plenodomus biglobosus对琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）抗性的发现与特征解析

《Pest Management Science》：Discovery and characterisation of succinate dehydrogenase inhibitor resistance in Plenodomus biglobosus (phoma stem canker of oilseed rape)

　　

背景：油菜茎秆溃疡病（PSC）是由两种亲缘真菌病原体复合体——Plenodomus lingam（Leptosphaeria maculans）和P. biglobosus（L. biglobosa）引起的。尽管P. biglobosus日益被认为是重要的PSC病原体，但其对琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI；FRAC第7组）杀菌剂的敏感性仍知之甚少。 结果：对来自英国（2025年）和波兰（2024年）的P. biglobosus分离株进行的体外敏感性测试显示，对啶酰菌胺（boscalid）和氟吡菌酰胺（fluxapyroxad）的抗性在英国占主导地位，95%（19/20）的分离株被归类为抗性，而波兰仅为6%（1/17）。对啶酰菌胺的抗性因子（RFs）高达约500，对氟吡菌酰胺高达265，并观察到强烈的正交叉抗性（R2 = 0.96）。对覆盖所观察SDHI敏感性范围的部分分离株进行SDHB、SDHC和SDHD亚基测序，发现SDHC和/或SDHD突变，而SDHB保持野生型。低抗和中抗分离株携带单一SDH突变，而高抗分离株携带双重SDH突变；所有被测序的抗性分离株均表现出独特的SDH突变谱。在P. biglobosus中鉴定出的SDH突变均与其他真菌中与SDHI抗性相关的突变同源。相比之下，氟吡菌酰胺（fluopyram）表现出部分交叉抗性，敏感性变化适中（RF ≤ 4.5）。体外适应性测定未显示SDH突变对菌丝生长或无性产孢有一致性影响。 结论：本研究首次确认了P. biglobosus中的SDHI抗性。这些发现对PSC及抗性管理具有重要意义，强调需要针对该病原复合体中的两个物种进行可持续病害防控。? 2026作者。《Pest Management Science》由John Wiley & Sons Ltd代表Society of Chemical Industry出版。

论文解读

一、研究背景与问题

油菜茎秆溃疡病（Phoma stem canker, PSC）是油菜（Brassica napus）上一种国际重要病害，由Plenodomus lingam与P. biglobosus两种亲缘真菌复合侵染引起，可造成30%–50%的产量损失。长期以来，P. lingam被视为更具危害性的病原，但越来越多的证据表明P. biglobosus的作用被严重低估。例如，在英国，P. biglobosus在茎秆溃疡病斑中的检出频率从2000年的14%上升至2013年的95%；在法国，其分布与丰度远超以往认知；而在中国，P. biglobosus是唯一被检测到的致病种并造成显著产量损失。除寄主抗性基因部署、气候变化及种间竞争等农艺与生物因素外，杀菌剂敏感性差异长期被认为可能影响两种病原的种群动态。甾醇脱甲基抑制剂（DMI，FRAC第3组）目前是化学防治PSC的基石，但近期已确认两个物种均出现DMI敏感性下降，且机制不同：P. biglobosus与CYP51基因编码区突变（G476S）相关，P. lingam则与上游启动子插入驱动的CYP51过表达相关。相比之下，关于P. biglobosus对琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI，FRAC第7组）的敏感性所知甚少。早期研究（2010–2013年英国分离株及2022–2023年法英分离株）均未发现SDHI抗性证据。然而，2024年澳大利亚在P. lingam中首次发现SDHI抗性，且英国油菜上SDHI（如联苯吡菌胺bixafen）使用量近年显著增加，提示P. biglobosus存在抗性出现的潜在风险。因此，亟需对当代P. biglobosus分离株开展系统的SDHI敏感性调查。

二、研究内容与结论

本研究首次确认了P. biglobosus中的SDHI抗性。研究人员对2024年采集自波兰的17株及2025年采集自英国的20株共37株P. biglobosus分离株进行了体外敏感性测定，发现对啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的抗性在英国高度流行（95%），而波兰仅为6%。抗性因子（RF）对啶酰菌胺最高约500，对氟吡菌酰胺最高约265，两药间存在极强正交叉抗性（R²=0.96）。对12株代表性分离株的SDHB、SDHC、SDHD基因测序显示，所有抗性菌株均携带SDHC和/或SDHD突变，SDHB保持野生型；低抗与中抗菌株为单一SDH突变，高抗菌株为双重SDH突变，且所有抗性菌株的SDH突变谱各不相同。这些突变均与其他真菌中已知的SDHI抗性突变同源。氟吡菌酰胺仅表现出部分交叉抗性，RF≤4.5。体外适应性测定未发现SDH突变对菌丝生长或无性产孢存在一致性代价。该研究对PSC防控及杀菌剂抗性管理具有重要指导意义，强调必须同时针对病原复合体中的两个物种制定可持续防控策略。

三、主要关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）体外敏感性表型测定：采用96孔微板液体培养法，以分生孢子悬浮液接种含系列浓度杀菌剂的Sabouraud葡萄糖肉汤（SAB），18°C暗培养10天后通过630 nm光密度（OD）测定计算半数有效浓度（EC₅₀），分别评估37株分离株对啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的敏感性，并对12株核心分离株测试氟吡菌酰胺敏感性；（2）靶位点基因测序：针对SDHB、SDHC、SDHD三个亚基的完整编码区设计引物，对12株覆盖不同敏感性表型的核心分离株进行PCR扩增、测序与序列组装，鉴定非同义突变；（3）交叉抗性分析：利用Pearson相关系数评估不同SDHI杀菌剂EC₅₀值间的相关性；（4）适应性测定：通过菌落径向生长速率（mm day^?1）和每皿总产孢量评估SDH突变可能带来的适应性代价，采用Kruskal–Wallis检验及Dunn多重比较进行统计分析。样本来源包括2024年波兰茎部病样和2025年英国叶片（除1株来自诺福克茎部）病样。

四、研究结果

3.1 P. biglobosus对三种SDHI杀菌剂的体外敏感性**：对37株分离株的测定显示，啶酰菌胺和氟吡菌酰胺均将分离株清晰划分为敏感、低抗、中抗和高抗四个表型组。波兰分离株绝大多数敏感（16/17，94.1%），仅1株中抗；英国分离株则绝大多数抗性（19/20，95%），其中中抗10株（50%）、高抗7株（35%），抗性表型广泛分布于英格兰南部和东部多个郡。高抗菌株对啶酰菌胺的RF达208–496，对氟吡菌酰胺达105–265。相比之下，氟吡菌酰胺敏感性范围窄得多，12株核心菌株中6株敏感、6株仅表现为敏感性下降（RF 2.2–4.5），且波兰和英国均有分布。

3.2 SDHI杀菌剂间的交叉抗性模式：啶酰菌胺与氟吡菌酰胺EC₅₀值间存在极强正交叉抗性（n=37，r=0.98，R²=0.96，P<0.001）。氟吡菌酰胺与啶酰菌胺（R²=0.56，P=0.005）及氟吡菌酰胺与氟吡菌酰胺（R²=0.52，P=0.008）间存在中等强度相关，但敏感性变化幅度远小于前两者，表明仅存在部分交叉抗性。

3.3 SDH亚基测序及与SDHI敏感性表型的比较：12株被测序菌株中，4株对啶酰菌胺和氟吡菌酰胺敏感的菌株均为SDH野生型（WT）；8株抗性菌株各携带独特的SDH突变基因型，突变仅发生在SDHC和/或SDHD，SDHB均为WT。对两种杀菌剂的敏感性从WT、单一SDH突变（低抗、中抗）到双重SDH突变（高抗）依次递减，支持SDHC与SDHD突变的加性效应。氟吡菌酰胺则呈现不同模式：4株WT和2株单一突变菌株保持敏感，其余6株单一或双重突变菌株仅出现≤4.5倍的敏感性下降。

3.4 SDH突变对菌丝生长的潜在适应性代价：12株已知SDH基因型菌株的径向生长速率总体相近。Kruskal–Wallis检验显示菌株间存在显著差异（H=24.14，df=11，P=0.012），但经Bonferroni校正的Dunn事后检验未发现任何显著的菌株两两差异，表明未检测到与特定SDH突变相关的明确生长代价。

3.5 SDH突变对无性产孢的潜在适应性代价：除菌株24–38-4（SDHC-H134R）外，绝大多数菌株产孢旺盛，WT、单一突变及双重突变菌株的产孢量总体相近。Kruskal–Wallis检验显示菌株间存在显著差异（H=25.83，df=11，P=0.007），但Dunn事后检验仅发现24–38-4与25KENTUK01（SDHD-G138D，P=0.00065）及25HERTSUK02（SDHC-H134N，P=0.00042）间存在显著差异。该结果提示24–38-4产孢减少可能属于菌株特异性变异，而非SDHC-H134R突变本身带来的一致性适应性代价。

五、讨论与结论

本研究发现英国P. biglobosus种群中啶酰菌胺和氟吡菌酰胺抗性高度流行，波兰亦检出首例抗性，且体外测定未显示明显适应性代价，提示SDHI抗性可能已在田间稳定存续并可能影响实际防效。英国与波兰抗性频率的显著差异可能与两国SDHI（尤其是联苯吡菌胺）使用强度及采样时间差异有关。所有抗性菌株均携带SDHC和/或SDHD突变，SDHB保持野生型，与P. lingam中发现的SDHB和SDHD突变路径不同，提示两个物种正沿不同进化路径走向SDHI敏感性下降。抗性菌株SDH突变谱高度多样且缺乏克隆信号，更符合多次独立进化事件。氟吡菌酰胺仅表现出部分交叉抗性，可能与其在SDH酶中的灵活结合方式有关。由于FRAC将所有SDHI视为单一作用位点，任何单一有效成分的抗性都可能威胁整个类别的药效，且部分交叉抗性带来的优势可能是短暂的。初步数据显示英国P. lingam仍对SDHI敏感，但澳大利亚2024年已在该物种中发现抗性，提示欧洲存在抗性出现的风险。两个物种间SDHI敏感性差异可能成为驱动P. biglobosus在英国重要性上升的此前未被识别的因素。研究人员强调，抗性管理策略必须同时应对双重风险：防止P. biglobosus中抗性的进一步选择，以及预防P. lingam中抗性的出现。为此，SDHI施用应限制为每季最少喷施次数，且仅与其他有效作用位点杀菌剂（如DMI）混用，并持续对两个物种开展敏感性监测，以便及早发现变化并调整管理建议。