水飞蓟素对幽门螺杆菌生长与黏附的抑制作用：体外实验及计算机模拟评价

《Frontiers in Natural Products》：Effect of silymarin on Helicobacter pylori growth and adhesion: in vitro and in silico evaluation

　　

摘要：背景：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是胃部疾病和胃癌的主要危险因素之一，其定植于胃黏膜、诱导慢性炎症并表达参与细菌持续存在的毒力黏附素。水飞蓟素（silymarin）是从水飞蓟（Silybum marianum）中提取的黄酮木脂素复合物，具有抗氧化、抗炎和抗菌特性，提示其对幽门螺杆菌可能具有潜在治疗应用价值。本研究旨在评估水飞蓟素对幽门螺杆菌及其主要黏附素BabA、SabA和HopQ的抗菌、抗黏附、抗炎、细胞毒性及计算机模拟相互作用谱。方法：通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）以评估抗菌活性。采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）分析形态学改变。通过MTT法使用AGS胃腺癌细胞和RAW 264.7巨噬细胞评估细胞毒性。在刺激的巨噬细胞中定量检测TNF-α、IL-6和一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生。使用FITC标记的幽门螺杆菌在AGS细胞中的黏附试验测定抗黏附活性。对水飞蓟素中的主要黄酮木脂素进行分子对接和理化性质预测。结果与讨论：水飞蓟素对幽门螺杆菌ATCC 43504的MIC和MBC值均为128 μg mL^?1，生长抑制率为90.46%。SEM显示处理后细菌出现变形和类球菌样形态。水飞蓟素使TNF-α、IL-6和NO的产生分别降低80.82%、76.24%和97.50%。在黏附试验中，水飞蓟素抑制细菌附着率达25.87% ± 3.50%。分子对接显示黄酮木脂素与幽门螺杆菌黏附素之间存在有利相互作用。异水飞蓟宾A（isosilybinin A）对BabA表现出最高亲和力（fitness score = 57.75），与CYS189和SER244形成氢键；异水飞蓟亭（isosilychristin）与SabA呈现最佳相互作用（fitness score = 74.79），与LYS152和GLN159相互作用；而水飞蓟亭（silychristin）对HopQ表现出最高亲和力（fitness score = 66.42），与SER135、ILE130和ILE242相互作用。水飞蓟素对幽门螺杆菌ATCC 43504表现出显著的抗菌、抗炎和抗黏附活性，支持其作为多功能天然治疗候选药物用于管理幽门螺杆菌相关胃部疾病的潜力。

水飞蓟素（silymarin）是来源于水飞蓟（Silybum marianum L. Gaertn）果实和种子的黄酮木脂素复合物，由多种活性成分组成，其中水飞蓟宾（silybinin）A和B约占复合物的70%，并含有异水飞蓟宾A/B、水飞蓟亭、异水飞蓟亭、水飞蓟宁及花旗松素等成分。该复合物以抗氧化、保肝、抗炎和抗纤维化作用著称，近期研究提示其具有胃黏膜保护和抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）活性。幽门螺杆菌是胃癌的主要危险因素，其定植依赖于多种黏附素（如BabA、SabA和HopQ）与胃上皮细胞表面受体的结合，并触发以TNF-α、IL-6和一氧化氮（NO）升高为特征的慢性炎症。然而，抗生素耐药性日益严重，传统含克拉霉素的三联疗法和含铋剂的四联疗法疗效下降，亟需开发新型多靶点治疗策略。本研究旨在系统评估水飞蓟素对幽门螺杆菌ATCC 43504的抗菌、抗黏附、抗炎活性及细胞毒性，并通过分子对接预测其主要黄酮木脂素与黏附素的相互作用。

研究人员采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；使用扫描电子显微镜（SEM）观察细菌形态；通过MTT法在AGS胃腺癌细胞和RAW 264.7巨噬细胞中评估细胞毒性并计算选择性指数（SI）；在幽门螺杆菌刺激的RAW 264.7巨噬细胞中定量检测TNF-α、IL-6和NO水平；利用FITC标记的幽门螺杆菌黏附AGS细胞试验评估抗黏附活性；运用GOLD和AutoDock Vina软件对水飞蓟素中八种主要黄酮木脂素与BabA（PDB：4ZH7）、SabA（PDB：4O5J）和HopQ（PDB：6GBG）进行分子对接，并通过ADMETlab 3.0和SwissADME预测理化性质及类药性。

研究结果显示：水飞蓟素对幽门螺杆菌ATCC 43504的MIC和MBC均为128 μg mL^?1，生长抑制率达90.46%。SEM观察到水飞蓟素处理后的细菌出现表面不规则、细胞变形及类球菌样形态，提示其可能通过破坏膜完整性发挥杀菌作用。细胞毒性试验中，水飞蓟素对AGS细胞的IC₅₀为46.27 ± 0.98 μg mL^?1，对RAW 264.7巨噬细胞的IC₅₀为98.18 ± 7.41 μg mL^?1，选择性指数为2.12，表明其对肿瘤细胞具有一定选择性，且免疫调节实验所用浓度维持巨噬细胞活力高于90%，排除了细胞毒性干扰。在抗炎实验中，50 μg mL^?1水飞蓟素使TNF-α、IL-6和NO的产生分别降低80.82% ± 2.79%、76.24% ± 17.79%和97.50% ± 2.19%。黏附试验中，水飞蓟素在256 μg mL^?1（2×MIC）浓度下抑制幽门螺杆菌对AGS细胞黏附率达25.87% ± 3.50%，呈浓度依赖性。理化性质预测显示八种化合物的logP值介于0.85至1.85，logS值介于?4.45至?3.33，均符合利平斯基五规则，提示良好的口服生物利用度。分子对接结果显示，所有黄酮木脂素均能与三种黏附素结合，其中异水飞蓟宾A对BabA的ChemPLP适应度分数最高（57.75），与CYS189和SER244形成氢键；异水飞蓟亭对SabA的适应度分数最高（74.79），与LYS152和GLN159相互作用；水飞蓟亭对HopQ的适应度分数最高（66.42），与SER135、ILE130和ILE242形成弱氢键和疏水作用。AutoDock Vina验证结果与GOLD打分趋势一致。

讨论部分指出，水飞蓟素的抗菌活性可能源于多种黄酮木脂素的协同作用，其MIC（128 μg mL^?1）低于纯水飞蓟宾单独使用时的MIC（256 μg mL^?1）。水飞蓟素诱导的形态改变与膜靶向机制一致，先前研究也证实水飞蓟素可增加膜通透性。抗炎方面，水飞蓟素显著抑制IL-6、TNF-α和NO的产生，与已知的水飞蓟素通过阻断NF-κB/Rel转录活性下调促炎基因表达的机制相符；特别是NO抑制率（97.50%）高于纯水飞蓟宾（73.33%），提示复合物成分间存在互补或相加作用。虽然水飞蓟素的抗黏附活性仅为中等程度，但与绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯、蔓越莓原花青素等天然化合物的抗幽门螺杆菌黏附效果相当。分子对接结果支持黄酮木脂素可通过氢键和疏水作用与BabA、SabA和HopQ的保守氨基酸残基结合，从而干扰细菌定植。需要注意的是，对接实验使用单一化合物而非完整复合物，结果仅为机制层面的支持证据。

研究结论：商业标准化的水飞蓟素复合物对幽门螺杆菌ATCC 43504表现出显著的抗菌和抗炎活性，同时能够减少细菌对AGS胃上皮细胞的黏附，提示其可干扰参与定植的重要黏附素。针对水飞蓟素中主要黄酮木脂素进行的分子对接分析提供了补充性机制见解，表明其与BabA、SabA和HopQ等黏附素的活性位点存在潜在相互作用。由于细菌附着是幽门螺杆菌感染建立和持续的关键步骤，本研究所观察到的细胞黏附抑制作用进一步强化了水飞蓟素作为一种多功能治疗候选药物的潜力，能够同时调控细菌生长、毒力和炎症。