《Frontiers in Immunology》：Selpercatinib mitigates microglia-mediated neuroinflammation by inhibiting RET signaling and NLRP3 inflammasome activation
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背景：Selpercatinib是一种高选择性转染重排（RET）受体酪氨酸激酶抑制剂，已获批用于RET融合阳性癌症，并已知能够穿透血脑屏障。尽管RET信号已被证实参与神经发育和细胞存活，但其在小胶质细胞介导的神经炎症及NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（
背景：Selpercatinib是一种高选择性转染重排（RET）受体酪氨酸激酶抑制剂，已获批用于RET融合阳性癌症，并已知能够穿透血脑屏障。尽管RET信号已被证实参与神经发育和细胞存活，但其在小胶质细胞介导的神经炎症及NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体激活中的作用仍知之甚少。本研究探讨了Selpercatinib是否通过调节RET依赖性激酶级联反应来减轻小胶质细胞中的神经炎症信号。
方法：使用脂多糖（LPS；200 ng/mL）诱导BV2小胶质细胞神经炎症，随后给予Selpercatinib（5 μM）处理。体内验证实验中，雄性C57BL/6N小鼠接受全身性LPS注射（10 mg/kg，腹腔注射），随后给予Selpercatinib（10 mg/kg，腹腔注射），并收集海马组织进行分析。采用实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、免疫细胞化学和流式细胞术评估促炎基因表达、RET相关信号通路、小胶质细胞表型标志物及NLRP3炎症小体组分。使用靶向RET的siRNA对RET参与LPS诱导的炎症信号进行遗传学验证。
结果：Selpercatinib降低了LPS刺激的BV2小胶质细胞中RET在Tyr1062位点的磷酸化，并降低了促炎介质（包括il-1β、il-6、tnf-α、cox-2、inos、ccl-2和ccl-7）的mRNA表达。机制上，Selpercatinib减弱了AKT和ERK磷酸化，抑制了NF-κB核转位，并降低了CREB磷酸化。同样，RET敲低降低了LPS诱导的促炎基因表达，并减弱了AKT/ERK–NF-κB/CREB信号，为RET参与这些炎症反应提供了遗传学证据。Selpercatinib还通过降低反应性小胶质细胞标志物（包括CD16/32、疾病相关小胶质细胞相关Clec7a及小胶质细胞神经退行性表型相关Galectin-3）的表达来调节LPS诱导的小胶质细胞活化，同时增加了与组织修复相关的标志物CD206。此外，Selpercatinib显著降低了LPS诱导的细胞内活性氧（ROS）生成。进一步地，Selpercatinib抑制了NLRP3炎症小体激活，表现为BV2小胶质细胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD和IL-1β水平降低。与体外研究结果一致，Selpercatinib在体内减弱了LPS诱导的海马il-1β基因表达，并降低了小鼠海马中NLRP3炎症小体相关蛋白（包括ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1及GSDMD-F和GSDMD-N）的水平。
结论：Selpercatinib通过调节RET相关AKT/ERK–NF-κB/CREB信号通路和抑制NLRP3炎症小体激活，减轻了小胶质细胞介导的神经炎症反应的发展。这些发现为进一步研究Selpercatinib作为神经炎症反应早期干预药物提供了机制基础。
神经炎症是中枢神经系统（CNS）中由固有免疫细胞活化及促炎介质产生所驱动的精密调控过程。小胶质细胞作为CNS的主要免疫细胞，在脂多糖（LPS）等刺激下启动并放大神经炎症反应，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）等炎症介质，经由AKT、细胞外信号调节激酶（ERK）和核因子-κB（NF-κB）等胞内信号通路介导炎症基因转录。神经炎症的失控参与多种神经系统疾病的发生发展，因此抑制过度炎症激活成为潜在治疗策略。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是CNS固有免疫反应的核心调控复合物，激活后招募凋亡相关斑点样蛋白（ASC），促进pro-caspase-1裂解为活化形式，进而加工pro-IL-1β为成熟形式并切割gasdermin D（GSDMD），放大炎症反应。转染重排（RET）受体酪氨酸激酶在神经发育和细胞存活中具有重要作用，且Selpercatinib作为高选择性RET抑制剂已证实可穿透血脑屏障，但RET信号是否参与小胶质细胞介导的神经炎症及炎症小体激活仍不清楚。此外，小胶质细胞在病理刺激下呈现异质性状态，包括稳态、疾病相关小胶质细胞（DAM）和神经退行性小胶质细胞（MGnD）等表型，促炎激活常伴随CD16/32、Clec7a和Galectin-3表达升高，而组织修复相关状态以CD206表达为特征。基于上述背景，研究人员开展本研究以探究Selpercatinib对LPS诱导的神经炎症反应的影响及其分子机制。
研究人员采用LPS（200 ng/mL）刺激BV2小胶质细胞建立体外神经炎症模型，并在LPS刺激后30 min给予Selpercatinib（5 μM）处理。体内实验中，雄性C57BL/6N小鼠经腹腔注射LPS（10 mg/kg）诱导急性神经炎症，随后给予Selpercatinib（10 mg/kg，腹腔注射）。研究运用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测促炎基因表达，蛋白质印迹（western blot）分析RET、AKT、ERK、NF-κB、CREB磷酸化水平及NLRP3炎症小体组分蛋白表达，免疫细胞化学染色评估小胶质细胞表型标志物变化，流式细胞术检测胞内活性氧（ROS）生成，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-1β蛋白水平。为验证RET的遗传学参与，研究人员采用靶向RET的siRNA（siRET）进行基因敲低实验，并以 scrambled siRNA（siSCR）作为对照。
研究结果部分，第一，Selpercatinib抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞中RET磷酸化及促炎反应。CCK-8实验表明5 μM Selpercatinib不影响细胞活力。Selpercatinib降低RET在Tyr1062位点的磷酸化而不改变总RET表达。siRET敲低显著降低RET表达及p-RET水平，并减少LPS诱导的il-1β、il-6、tnf-α和cox-2 mRNA表达，与Selpercatinib效果一致，证实RET参与LPS诱导的炎症信号。
第二，Selpercatinib减弱LPS刺激的BV2小胶质细胞中AKT和ERK信号。LPS增加AKT Ser473和ERK Thr202/Tyr204磷酸化，Selpercatinib显著降低两者磷酸化水平而不影响总蛋白表达。siRET敲低同样降低LPS诱导的AKT和ERK磷酸化，提示RET是这些炎症信号通路的上游调控因子。
第三，Selpercatinib抑制LPS诱导的NF-κB和CREB激活。Selpercatinib降低LPS诱导的核内p-NF-κB（Ser536）水平及CREB Ser133磷酸化，免疫细胞化学证实p-NF-κB核积聚减少。siRET敲低同样显著降低核内p-NF-κB水平和CREB磷酸化，表明RET参与调控这些转录因子的激活。
第四，Selpercatinib调节小胶质细胞表型标志物表达并减少ROS生成。Selpercatinib降低LPS诱导的CD16/32、Clec7a和Galectin-3荧光强度，同时增加CD206表达。流式细胞术显示Selpercatinib显著降低LPS诱导的胞内ROS生成。
第五，Selpercatinib抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症小体激活。Selpercatinib降低NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1和GSDMD-F蛋白水平，ELISA证实IL-1β产生减少，免疫细胞化学显示NLRP3和caspase-1免疫反应性降低。
第六，Selpercatinib在体内减弱LPS诱导的海马炎症及炎症小体激活。在LPS诱导的急性神经炎症小鼠模型中，Selpercatinib降低海马il-1β mRNA表达，并减少NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD-F和GSDMD-N蛋白水平。低剂量（1和5 mg/kg）实验中，1 mg/kg显著降低GSDMD-N水平，5 mg/kg显著降低GSDMD-F水平，其他炎症小体相关蛋白呈下降趋势但未达统计学显著。雌性小鼠中10 mg/kg Selpercatinib同样显著降低多种炎症小体相关蛋白水平。
讨论部分总结，本研究表明早期LPS后给予Selpercatinib可通过调节RET相关AKT/ERK–NF-κB/CREB信号通路和抑制NLRP3炎症小体激活，减轻小胶质细胞介导的神经炎症反应的发展。RET在Tyr1062位点的自磷酸化是招募接头蛋白并偶联下游PI3K/AKT、RAS/ERK等信号的关键事件，Selpercatinib对该位点磷酸化的抑制有效阻断了促炎信号级联。值得注意的是，LPS刺激并未增加GDNF分泌或RET磷酸化，提示LPS/TLR4与RET信号可能通过共享下游通路（如AKT和ERK）发挥作用，而非依赖配体直接激活RET。NF-κB作为LPS/TLR4信号的下游经典转录因子，其核转位被Selpercatinib和siRET敲低一致抑制，CREB磷酸化同样被两者减弱，进一步支持RET参与调控这些炎症转录程序。在小胶质细胞表型方面，Selpercatinib在抑制促炎和疾病相关标志物的同时增强CD206表达，提示其促进小胶质细胞向较低炎症状态偏移，但CD206单独表达不足以定义明确的功能表型，需更广泛的分子和功能谱表征。Selpercatinib对NLRP3炎症小体的抑制可能与其对NF-κB介导的priming信号的调控相关，因为NF-κB是NLRP3和IL-1β转录诱导的关键转录因子。研究中Selpercatinib在LPS后30 min给药，早于炎症小体的完全激活，因此其作用是抑制炎症小体相关炎症反应的发展而非逆转已建立的炎症小体应答。
研究结论为，在LPS刺激的BV2小胶质细胞中，Selpercatinib抑制RET磷酸化，减弱AKT/ERK和NF-κB/CREB信号，调节小胶质细胞活化标志物表达，并降低炎症小体相关蛋白表达。这些抗炎效应在LPS攻击小鼠中得到验证，表现为海马促炎细胞因子表达和炎症小体激活的减少。综上所述，这些发现为进一步研究Selpercatinib作为神经炎症反应早期干预药物提供了机制基础，而采用延迟治疗范式的研究将有助于确定其对已确立的神经炎症的疗效。
