基于银掺杂生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶分子级杂合生物墨水：提升细胞活性与抗菌性能的三维生物打印平台

《Advanced Healthcare Materials》：A New Bioactive Glass-Based Hybrid Bioink With Enhanced Cell Viability and Antibacterial Properties

　　

专业术语翻译：

三维生物打印（three-dimensional bioprinting, 3DBP）技术的近期进展使得定制化骨替代物的生产成为可能。然而，颗粒相中的骨传导材料在挤出过程中可能损伤细胞，导致3DBP后细胞活性不佳。研究人员开发了一种细胞友好、骨诱导且具有抗菌性能的生物墨水。为实现这一目标，研究人员将甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl, GelMA）与银掺杂生物活性玻璃陶瓷（Ag-doped bioactive glass-ceramic, Ag-BaG）在分子水平上通过（3-缩水甘油醚氧基丙基）三甲氧基硅烷（(3-Glycidoxypropyl) trimethoxysilane, GPTMS）结合，制备了GelMA-AgBaG（GAB）杂合材料，并将其特性与GelMA及GelMA-AgBaG共混纳米复合材料进行了比较。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM-EDS）观察到GAB中元素分布均匀。流变学研究显示其具有强剪切稀化特性和高储能模量。长达30天的溶胀和降解行为表明该材料适用于短期应用。GAB的细胞相容性及其抗菌性能得到验证，挤出后细胞活力显示，GAB中细胞死亡率仅为2%，而纯GelMA为5%，共混物（GelMA-Ag-BaGNPs）约为35%。挤出构建体和生物打印支架随时间表现出代谢活性和细胞活力，其中负载细胞的GAB相比GelMA和纳米复合共混物表现出更高的细胞活力。因此，杂合材料GAB具备先进的多功能特性，表明GAB是组织再生的有吸引力的生物材料。

论文解读文章：

一、研究背景与问题

骨缺损是骨科和颅颌面（craniomaxillofacial, CMF）外科面临的重大临床挑战。自体骨移植虽为金标准，但受限于供体来源、供区并发症及难以塑形等问题；同种异体骨移植成本高、过程繁琐，并存在再血管化受限、免疫反应及感染风险。全球每年约进行两百万例骨移植手术，感染性骨缺损常需二次翻修手术，延长恢复时间并可能导致永久性功能丧失。因此，开发实用的组织工程方法以再生受损组织并抵抗感染至关重要。

三维生物打印（3DBP）技术能够实现活细胞、生物分子及基质组分的空间可控沉积，在骨组织工程中具有广阔前景。然而，当前用于骨3DBP的生物墨水通常将骨诱导性无机颗粒（如生物活性玻璃BaG、磷酸钙陶瓷等）以颗粒形式简单地共混于聚合物基体中。这种传统复合生物墨水存在颗粒分布不均、团聚风险等问题，团聚颗粒在挤出过程中会对细胞造成机械损伤，导致细胞活性显著下降。例如，当成骨细胞被负载到纳米纤维素和生物活性玻璃修饰的明胶-海藻酸盐生物墨水中时，已观察到细胞损伤和死亡现象。因此，迫切需要开发兼具骨诱导功能且细胞友好的新型生物墨水。

二、研究内容与结论

针对上述问题，研究人员提出了一种在分子水平上结合多种组分的杂合生物墨水策略：以甲基丙烯酰化明胶（GelMA）提供细胞黏附所需的精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）序列和光交联能力，以银掺杂生物活性玻璃陶瓷（Ag-BaG）提供骨诱导和抗菌功能，并通过偶联剂（3-缩水甘油醚氧基丙基）三甲氧基硅烷（GPTMS）将有机相与无机相共价连接，制备了GelMA-AgBaG（GAB）杂合生物墨水。同时，研究人员合成了不含偶联剂的GelMA与Ag-BaG纳米颗粒共混复合物（GelMA-Ag-BaGNPs）以及纯GelMA作为对照。研究结果表明，GAB在分子水平上实现了有机-无机相的均匀结合，元素分布均匀，表现出强剪切稀化行为和高储能模量，具有良好的3D打印性能。GAB的溶胀率低于共混物和纯GelMA，降解行为表明其可在约一个月内完全降解，适用于短期组织工程应用。抗菌实验显示GAB对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有剂量依赖的抑制作用，在500 mg mL^?1浓度下可减少75%的细菌活力。细胞相容性实验显示，GAB培养的细胞活力显著高于纯GelMA和共混物。挤出后细胞活力分析表明，GAB中死细胞比例仅为2%，远低于纯GelMA的5%和共混物的35%。3D生物打印实验进一步证实，负载间充质干细胞（MSCs）的GAB构建体在7天培养期间维持了良好的细胞活力。此外，碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红染色结果证实GAB增强了成骨分化能力。血液相容性测试显示GAB的溶血率低于5%阈值，具有良好的血液相容性。该研究发表在《Advanced Healthcare Materials》，表明GAB是一种具有先进多功能特性的生物墨水，可望用于推进挤出式3DBP在骨组织工程中的应用。

三、主要关键技术方法

研究人员首先采用有机溶剂二甲基亚砜（DMSO）中合成GelMA，并使用甲苯沉淀法纯化，获得接近100%的甲基丙烯酰化取代度。GAB合成过程中，同时制备Ag-BaG溶胶，并通过GPTMS将GelMA与Ag-BaG在分子水平偶联，经沉淀、洗涤、冻干得到杂合材料。共混物GelMA-Ag-BaGNPs则通过将预先合成的Ag-BaG纳米颗粒与GelMA简单混合制备，无偶联剂。材料表征采用核磁共振（¹H-NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认化学结构，扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）评估形貌和元素分布，流变学测试表征黏弹性和剪切稀化行为，溶胀和降解实验评估稳定性。打印性能通过3D打印参数优化和打印性参数（Pr）半定量评估。细胞实验使用人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）和大鼠脂肪来源间充质干细胞（MSCs），通过MTT实验、Live/Dead染色、ALP活性检测和茜素红染色评估细胞活力、增殖和成骨分化。抗菌实验以MRSA USA300JE2为测试菌株。

四、研究结果

3.1 结构、化学与形态特征
¹H-NMR和FTIR证实GelMA和GAB合成成功，甲基丙烯酰化取代度约为100%，GAB的FTIR光谱中保留了GelMA的酰胺I、II、III特征峰，并出现Si–O弯曲峰（约750–800 cm^?1），表明Ag-BaG成功掺入。甲苯沉淀法有效去除了合成试剂残留。SEM显示冻干GAB具有更厚的微米级纤维和更平滑的表面，GAB的元素（C、N、O、Si、Ca、Ag等）分布均匀至微米尺度，表明分子级杂合成功。UV光谱显示GAB在360–420 nm出现银还原特征峰，且随储存时间增强，表明银离子逐渐还原。

3.2 溶胀、pH与降解行为
GAB的溶胀率低于纯GelMA和共混物，因其共价键限制了吸水膨胀。pH演化实验中，GAB的pH变化接近纯GelMA，而共混物出现显著的碱性峰值（~8.8），说明GAB中GelMA能有效调控Ag-BaG的离子释放，避免局部碱化。降解研究显示，所有样品在动态和静态条件下均在大约40天内完全降解，其中前5天质量快速下降约60%，随后缓慢降解。GAB的稳定性优于共混物。

3.3 流变性能与打印性
GAB的储能模量约为75,000 Pa，比文献报道的GelMA高两个数量级，损耗模量也相应增加。GAB表现出强剪切稀化行为，流动行为指数n为0.045，属于高度剪切稀化的非牛顿流体。黏度随温度降低而增加，GAB在10°C时可实现最佳打印，而GelMA和共混物在12°C打印。所有水凝胶均成功打印出单层网格结构。

3.4 GAB的抗菌活性
GAB对MRSA表现出剂量依赖的抑制作用：10 mg mL^?1时细菌减少约10%，100 mg mL^?1时减少15%，500 mg mL^?1时减少75%。纯GelMA无抗菌活性。GAB未表现出杀菌效应，但预期延长暴露时间可产生杀菌作用。

3.5 细胞相容性、细胞活力与血液相容性
MTT实验显示，GAB培养的细胞在1、3和6天的活力分别比对照组和纯GelMA高约30%，第6天时比共混物高28%，比纯GelMA高26%。所有水凝胶均无细胞毒性。血液相容性测试中，GAB的红细胞存活率约98%，共混物约95%，而纯GelMA低于95%阈值，表明GAB具有良好的血液相容性。

3.6 细胞分化
ALP活性检测显示，第7天GAB和共混物组的ALP活性显著高于纯GelMA和对照组，第14天虽然所有组下调，但GAB的下调速率显著更低。茜素红染色显示，所有水凝胶组的钙沉积均显著高于对照组，共混物组高于纯GelMA，表明GAB和共混物均能增强成骨分化。

3.7 挤出后细胞活力
Live/Dead染色显示，挤出后即刻和30分钟内，GAB中死细胞比例平均为2%，纯GelMA为5%，共混物为35%。表明GAB的分子级杂合结构有效降低了挤出剪切应力对细胞的损伤，而共混物中的纳米颗粒团聚导致细胞损伤加剧。

3.8 3D生物打印后的细胞活力
手动挤出的MSC和成纤维细胞负载GAB的代谢活性显著高于共混物和纯GelMA。3D生物打印的MSC负载GelMA和GAB网格在7天培养中均维持了细胞活力，GAB构建体在打印后第0天、第3天和第7天的细胞活力分别为64%、77%和77%，与GelMA无显著差异，表明3DBP过程未对细胞活力产生不利影响。

五、讨论与结论

讨论部分指出，GAB的剪切稀化行为赋予材料自修复能力，有利于高质量3D打印。温度-黏度关系表明所有水凝胶具有热可逆性，GAB在较低温度下打印可减少细胞所受的温度和剪切应力。与传统共混物相比，GAB通过分子级共价键结合无机相，避免了纳米颗粒团聚，从而在挤出过程中保护细胞活力。GAB的抗菌活性归因于Ag-BaG控制释放的Ag⁺离子，其对真核细胞无毒且能保持界面抗菌活性。GAB的成骨分化增强效果与Ag-BaG释放的离子（如Si、Ca）促进成骨相关基因表达一致。研究结论指出，GAB是一种先进的多功能杂合生物墨水，其有机-无机相分子级键合赋予其独特性能：可交联、溶胀率低、降解周期约一个月、抗菌、细胞相容性好、能增强成骨分化并适用于MSC负载的3D生物打印构建体。该材料有望推进挤出式3DBP在骨组织工程中的应用。