基于惯性螺旋微流控装置从液体活检中分离稀有肿瘤细胞的研究

《Bioengineering & Translational Medicine》：An inertial-based spiral device for separating rare tumor cells from liquid biopsies

　　

原发性肿瘤及转移过程的早期检测能够提高抗肿瘤治疗的成功率并有利于良好预后。在现有肿瘤检测方法中，液体活检（liquid biopsy）因其微创且快速的特点而受到特别关注。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）等肿瘤成分的鉴定可为肿瘤生物学提供有价值的信息。然而，由于此类细胞在血液等体液中极为稀少（CTCs <10个/10 mL血液），该过程极具挑战性。微流控（microfluidics）技术作为一种经济、灵敏、操作简便且快速发展的技术，已在稀有癌细胞检测与分离方面取得显著进展。目前采用的主要策略之一是开发具有螺旋几何结构的惯性聚焦（inertial focusing）装置。在此类系统中，流体动力被用于依据颗粒尺寸实现聚焦，无需额外的机械或电子设备。具体而言，惯性升力（inertial lift forces）与迪恩涡（Dean vortices）之间的相互作用决定颗粒随尺寸变化的平衡位置，从而增强分选效果。本研究通过结合粘弹性（viscoelastic）与惯性微流控方法，开发了一种用于从液体活检中分离CTCs的螺旋装置。该装置能够从全血样本中以高效率分离并富集低数量的骨肉瘤细胞。该装置有望成为从患者样本中分离、表征及潜在培养肿瘤细胞的有力工具，从而推动个性化医学的发展。

一、研究背景与问题

据最新全球估算，到2050年将有超过3000万人受癌症影响，与2022年相比，全球癌症病例将增加75%，癌症死亡人数将增加90%。癌症早期检测和诊断方法的改进对提高患者生存率至关重要。液体活检技术因其微创、快速的特点，在肿瘤早期检测和实时监测治疗反应方面受到广泛关注。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）作为肿瘤转移的基础，其在血液中的数量极低（<10个/10 mL血液），且存活时间不足1小时，这使得CTCs的检测和分离极具挑战性。然而，CTCs通常比白细胞略大且变形性较低，这一特征可用于将其与血液中其他细胞区分。

微流控技术因其成本低、灵敏度高、样本消耗少等优势，成为检测和分离稀有癌细胞的有力平台。惯性聚焦现象由Segré和Silberberg于1961年首次描述，此后螺旋微流控装置被广泛用于基于尺寸的颗粒和细胞分离。然而，现有螺旋装置在处理全血样本时通常需要预处理（如红细胞裂解、离心富集或大量稀释），这些步骤可能导致稀有肿瘤细胞的损失，且延长了处理时间。此外，不同螺旋几何形状、流速条件、流体密度对分离效率的影响仍需系统研究。

二、研究内容与主要结论

研究人员开发了两种基于惯性力的螺旋微流控装置——圆形（阿基米德螺旋）和椭圆形螺旋装置，用于从血液样本中分离和富集肿瘤细胞。通过系统研究流速、流体密度、颗粒尺寸和通道几何形状对分离效率的影响，研究人员发现：椭圆形螺旋设计相比圆形设计具有更好的分离和富集性能，且无需对血液进行经典预处理。最终开发的窄通道椭圆形螺旋装置能够在30分钟内从全血样本中高效分离低至500个骨肉瘤细胞，且分离后的细胞保持增殖能力，为个性化医学和肿瘤实时监测提供了有前景的工具。

三、关键技术方法

研究人员采用标准软光刻技术，使用SU-82075环氧光刻胶制备母模，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）聚合物按10:1比例与固化剂混合制备螺旋微通道。设计了三种螺旋装置：圆形螺旋（主通道530 μm宽×140 μm高，长宽比H/W=0.26，总长21 cm）、椭圆形螺旋（相同截面，总长25 cm）以及窄通道椭圆形螺旋（通道宽度缩减至320 μm，长宽比H/W=0.43）。使用三种不同尺寸（10、13和26 μm）的荧光聚苯乙烯微球模拟血液中的血小板/红细胞、白细胞和肿瘤细胞，以不同浓度牛血清白蛋白（BSA）溶液（30%、16%、8%和4%）模拟血液的密度和粘度。采用对称流速（800 μL/min）和非对称流速（PBS 2800 μL/min、样品600 μL/min）两种注射模式。人骨肉瘤细胞系MNNG-HOS（GFP过表达）和Jurkat细胞系用于细胞分离实验。健康人血液样本来自法国国家血液服务机构（EFS convention CPDL-PLER-2021 050）。

四、研究结果

2.1 对称或非对称流速对螺旋装置中单分散颗粒分布的影响

使用13 μm和26 μm聚苯乙烯微球分别在圆形和椭圆形螺旋装置中测试对称和非对称流速的影响。结果表明，非对称流速更适合将13 μm颗粒聚焦至中间出口（圆形螺旋相对分离效率90.3%±2.4%），而26 μm颗粒在两种流速下均主要分布于内侧出口。椭圆形螺旋在26 μm颗粒分离中表现更优（非对称流速下相对分离效率97.91%±1.36%）。

2.2 流体密度对单分散颗粒分布的影响

在非对称流速下测试不同BSA浓度（16%、8%、4%）对颗粒分离的影响。对于13 μm颗粒，降低BSA浓度导致分离效率下降（圆形螺旋从BSA 30%的90.3%降至BSA 4%的56.96%）；椭圆形螺旋中颗粒分布分散于中间和内侧出口。对于26 μm颗粒，圆形螺旋在低BSA浓度下分离效率反而提高（BSA 4%时为98.63%），而椭圆形螺旋在不同BSA浓度下均保持约97%以上的高分离效率，表明流体密度对椭圆形螺旋中大颗粒分离影响不大。

2.3 流体密度对混合尺寸颗粒分布的影响

使用10、13和26 μm颗粒混合液（比例为2000:1000:500）模拟血液中不同细胞群体的比例。在圆形螺旋中，10 μm颗粒分散于外侧和中间出口，13 μm颗粒主要位于中间出口（相对分离效率82.77%±10.66%），26 μm颗粒位于内侧出口（74.70%±21.95%）。在椭圆形螺旋中，13 μm颗粒因10 μm颗粒占据中间通道而部分偏移至内侧出口，相对分离效率降至35.12%±22.6%。降低BSA浓度未改善混合颗粒的分离效果。

2.4 流体密度和流速对骨肉瘤细胞分离的影响

使用500,000个MNNG-HOS骨肉瘤细胞（平均直径17.42 μm）进行分离实验。在圆形螺旋中，无论BSA浓度如何，细胞主要回收自中间出口，其分布行为类似13 μm颗粒而非26 μm颗粒，这可能与细胞变形性或尺寸异质性有关。在椭圆形螺旋中，细胞在中间和内侧出口间均衡分布。当MNNG-HOS细胞与Jurkat细胞（平均12 μm，代表白细胞）混合时，Jurkat细胞的存在促进了肿瘤细胞的聚焦，圆形螺旋中MNNG-HOS细胞相对分离效率提高至73.85%-85.56%。

在含40,000个MNNG-HOS细胞的全血样本中，非对称流速导致细胞异常分布于中间和外侧出口，这可能是由于血液中极高的细胞数量干扰了平衡力的建立。改用对称流速后，圆形螺旋将细胞显著重定位至内侧出口（31,657±3032个细胞），而椭圆形螺旋表现更优（38,026±4001个细胞），表明对称流速和椭圆形几何更适合从全血中分离肿瘤细胞。

基于上述发现，研究人员设计了窄通道椭圆形螺旋（通道宽度从530 μm缩减至320 μm，H/W=0.43）。在BSA 30%条件下，13 μm颗粒主要集中于中间出口，26 μm颗粒位于内侧出口；混合颗粒在BSA 16%条件下获得最佳分离效果（13 μm颗粒相对分离效率97.48%±0.97%，26 μm颗粒为82.73%±0.96%）。在含10,000、1000和500个MNNG-HOS细胞的全血样本中，窄通道椭圆形螺旋在对称流速下均能将肿瘤细胞显著富集至内侧出口，相对分离效率分别为78.07%±7.11%、71.52%±8.4%和84.83%±1.51%。分离后的MNNG-HOS细胞在48小时后仍保持增殖能力。

五、讨论与结论

本研究系统比较了圆形和椭圆形螺旋微流控装置在不同流速、流体密度和通道截面条件下的颗粒及肿瘤细胞分离效率。椭圆形螺旋因其两个曲率半径轴（x和y）产生交替的迪恩拖曳力，相比阿基米德圆形螺旋具有更好的分离效率，与Shamloo等人的计算模拟结果一致。通道截面长宽比的增加（从H/W=0.26增至0.43）增强了惯性升力作用，促进了颗粒聚焦，这与Nivedita等人和Rodriguez-Pena等人的研究结果相符。

流速对颗粒和细胞的影响存在差异：非对称流速有利于颗粒分离，而对称流速更适合细胞分离，这可能归因于细胞相对固体颗粒的变形性差异。BSA溶液可有效模拟全血的粘弹性特性，高浓度BSA（30%）条件下的颗粒行为与全血中细胞行为一致。与需要红细胞裂解、离心或大量稀释的传统螺旋装置不同，本研究的窄通道椭圆形螺旋装置可直接处理全血样本，无需预处理，处理时间少于30分钟，且能高效回收低至500个肿瘤细胞。

本研究存在一定局限性：未直接测量内部压力和通道变形对PDMS变形及流动行为的潜在影响；聚苯乙烯颗粒作为简化模型不能完全复现细胞的生物学行为（刚度、变形性、浮力及与通道壁的相互作用）。未来研究应采用更生理相关的模型和更坚硬的材料（如聚甲基丙烯酸甲酯）进一步验证装置性能。

综上所述，本研究开发的窄通道椭圆形螺旋微流控装置能够从全血样本中高效分离和富集稀有肿瘤细胞，分离后的细胞保持活力和增殖能力。该装置可作为临床中实时监测患者肿瘤演变和抗癌治疗效果的标准化工具，为个性化医学的发展提供了有前景的技术平台。