Poloxamer 188介导的AAV8衣壳稳定化机制：基于粗粒化分子动力学的浓度依赖性表面覆盖与空间位阻研究

《Pharmaceutical Research》：Mechanistic Insights into Poloxamer 188–Mediated Stabilization of AAV8 Capsids Using Coarse-Grained Molecular Dynamics

　　

目的：腺相关病毒（AAV）在生产与储存过程中的聚集仍是基因治疗制剂面临的挑战。本研究评估不同浓度泊洛沙姆188（Poloxamer 188, P188）对两个完整AAV8衣壳结构稳定性及聚集行为的影响。方法：采用粗粒化分子动力学（Coarse-Grained Molecular Dynamics, CG-MD）模拟，在300 K下对含P188的AAV8衣壳进行4000 ns模拟。分析了质心（Center-of-Mass, COM）分离、残基水平接触、表面覆盖度、范德华相互作用、回旋半径（radius of gyration, R_g）、相对形状各向异性（relative shape anisotropy, k²）以及模拟快照。结果：在含10或24个P188分子（0.15%和0.35% w/v）的系统中未观察到持续衣壳结合，而含2或5个P188分子（0.03%和0.07% w/v）的系统相对于无表面活性剂系统表现出延迟结合。衣壳表面覆盖度随P188载量增加而增加。聚环氧乙烷（polyethylene oxide, EO）片段早期持续结合衣壳表面，随后聚环氧丙烷（polypropylene oxide, PO）片段逐渐参与，表明一种优先/顺序相互作用机制。较高P188载量下范德华吸引力可忽略不计，与空间屏蔽一致。链分辨的R_g和k²曲线显示初始构象重排后，表面结合的P188构象趋于稳定，并具有不同的空间延展度和形状各向异性。结论：这些发现为P188通过浓度依赖性表面覆盖和空间位阻稳定AAV、从而减少与聚集相关的衣壳-衣壳相互作用提供了机制见解。所报告的浓度是由离散P188分子数定义的名义有限盒值，代表比较性模拟条件，而非实验推导的制剂阈值。这些发现为理解P188介导的AAV稳定化及指导制剂优化提供了分子基础。

论文解读

基因治疗为多种遗传疾病提供了新的治疗选择，腺相关病毒（AAV）载体因其高效转导能力和良好安全性被广泛应用。然而，AAV在生产、储存和运输过程中容易发生聚集，导致病毒生物利用度下降，是基因治疗制剂开发的主要挑战之一。非离子表面活性剂泊洛沙姆188（Poloxamer 188, P188）被广泛用于AAV制剂中，已有实验表明P188可改善AAV的回收率、感染性和冻融稳定性，但其分子层面的稳定机制尚不明确。以往研究多将P188作为复合制剂组分，难以单独评估其作用；或者实验技术无法提供分子级分辨率。因此，研究人员利用粗粒化分子动力学（Coarse-Grained Molecular Dynamics, CG-MD）模拟，系统考察不同P188浓度下两个完整AAV8衣壳的结构稳定性和聚集行为，揭示P188与衣壳表面相互作用的分子机制。

研究人员构建了包含两个负载单链DNA（ssDNA）的AAV8衣壳的CG-MD系统，分别加入2、5、10和24个P188分子（对应名义浓度0.03%、0.07%、0.15%、0.35% w/v），在300 K下模拟4000 ns，并与无P188的对照系统比较。结果发现：高浓度P188（10和24个分子）完全抑制了衣壳的持续结合，低浓度（2和5个分子）仅延迟聚集；表面覆盖度随P188载量增加而增大；EO片段先于PO片段结合衣壳表面；高浓度下衣壳间范德华能量接近零，表明不存在持续吸引。单个P188链的回旋半径（R_g）和形状各向异性（k²）分析显示，链在初始构象重排后形成延展的“披风状”（shroud-like）表面结合构象。这些结果说明P188通过浓度依赖的表面覆盖和空间位阻稳定AAV衣壳。

关键的技术方法：研究人员采用MARTINI 2力场和CHARMM-GUI工具将AAV8衣壳（PDB: 6V12）粗粒化，并将22 kb ssDNA压缩至18.5 nm后插入衣壳。P188使用PEG₈₀–PPGO₂₇–PEG₈₀三嵌段代表结构，每个EO或PO单元映射为MARTINI珠。使用GROMACS 2022进行NPT模拟，积分步长10 fs，温度300 K，压力1 bar。分析工具包括gmx distance、mindist、sasa、gyrate、polystat及MDAnalysis自定义脚本，统计COM距离、残基接触、表面覆盖度、vdW能量、R_g、k²等。所有模拟在高性能计算集群上运行，系统包括无P188对照及四种P188载量。

研究结果：

**结构稳定性分析（RMSD和RMSF）**：通过均方根偏差（RMSD）分析，所有P188系统在最初500 ns内快速上升后达到平台，其平台RMSD值约为1.14–1.16 nm，而无P188系统为0.89 nm。均方根涨落（RMSF）分析显示，无P188系统残基波动最大，P188系统整体波动降低，表明P188降低了衣壳局部柔性，增强了结构稳定性。

**聚集行为评估（COM距离分析）**：质心（COM）距离追踪显示，无P188系统在500 ns后快速接近，最终距离约25.3 nm；含2个P188分子系统在1500 ns时降至25.7 nm；含5个P188分子系统在2300 ns后降至26 nm；而含10和24个P188分子系统在整个模拟中距离保持33–36 nm，未发生持续聚集。

**接触分布与最小距离分析**：残基接触热图显示，EO和PO片段均与AAV8衣壳残基在0.6 nm截断内发生广泛接触，多数接触距离为4–6 ?，且接触总数随P188浓度增加而增加。EO片段比PO片段与衣壳接触更持久、更广泛。

**残基首次接触分析**：时间分辨首次接触图显示，在所有系统中EO片段均早于PO片段与衣壳接触；低浓度系统首次接触多发生在100–300 ns，高浓度系统则分散至约3000 ns，表明高浓度下存在分子间竞争，但总早期接触数相似。

**表面覆盖分析**：通过溶剂可及表面积（SASA）分析，P188在所有系统中均结合衣壳表面，表面覆盖度随P188数量增加而增加：24分子系统最终覆盖3.3%，10分子为1.4%，5分子为0.6%，2分子为0.3%。覆盖曲线先快速上升后趋于平台，表明P188在衣壳表面形成持续屏障。

**衣壳间范德华相互作用能量分析**：范德华（vdW）能量分析显示，无P188系统和含2、5个P188分子系统的vdW能量逐渐降低至约-7000 kJ/mol，表明形成强吸引力；而含10和24个P188分子系统的vdW能量始终接近零，表明不存在持续吸引力，与空间屏蔽一致。

**单个P188链的构象行为**：对含5个P188分子系统中5条链的R_g和k²分析显示，前500–700 ns内构象发生明显重排，随后趋于稳定。两条链具有较高的平均R_g和k²值，表明其延展程度和形状各向异性更大。快照显示P188在衣壳表面呈延展的“披风状”构象，而非紧凑球状。

讨论部分指出，高浓度P188通过表面结合和空间位阻有效抑制衣壳间吸引；低浓度仅延迟聚集。RMSD升高并不代表衣壳去稳定，而是P188结合引起的表面残基重排。RMSF降低说明P188限制了衣壳局部波动。接触分析表明EO片段优先结合衣壳，PO随后参与，形成逐渐稳定的表面结合。表面覆盖和链构象结果支持“表面装饰”机制。作者强调，虽然较高离子强度也能抑制聚集，本研究未加入盐，因此结果直接归因于P188。

结论可翻译为：本研究通过粗粒化分子动力学模拟，表征了不同浓度P188对两个完整AAV8衣壳结构稳定性、聚集行为和界面相互作用的影响。高浓度P188（10和24个分子，对应0.15%和0.35% w/v）增强了局部结构稳定性，并在整个模拟时间内维持衣壳间距高于聚集阈值，范德华能量持续为零，从而防止持续衣壳结合。低浓度（2和5个分子，对应0.03%和0.07% w/v）仅相对于无表面活性剂系统延迟聚集。表面覆盖分析显示P188在所有系统中均与衣壳表面结合，但较高载量产生更大的持续屏蔽，约在2000 ns达到平衡。时间分辨接触图显示EO片段更早且更持久地结合衣壳表面，PO片段逐渐参与。上述结果为P188在低于CMC浓度下通过表面结合和空间位阻稳定AAV衣壳提供了机制支持，为AAV制剂开发中的理性辅料选择和优化提供了分子框架。