荷斯坦犊牛腹腔镜卵母细胞采集联合幼畜体外胚胎生产与胚胎移植的初步研究

《Journal of Dairy Science》：Investigation of laparoscopic ovum-pickup in juvenile heifers followed by in vitro embryo production and embryo transfer in dairy cattle

　　

摘要专业翻译 本初步研究的目标是：（1）探究幼畜体外受精与胚胎移植（JIVET）在季节性放牧奶牛体系中的潜在应用；（2）为供体与受体管理提供见解，以助于未来研究的设计。研究人员通过腹腔镜卵母细胞采集（LOPU）从基因优良的荷斯坦弗里西亚供体犊牛（n = 49）卵巢中采集卵母细胞。经体外成熟（IVM）后，卵母细胞与来自8头经证实生育力良好的荷斯坦弗里西亚公牛的精子库中冷冻-解冻X分选精液进行体外受精（IVF），并培养7 d。共有87枚胚胎以新鲜状态移植至经孕酮-Ovsynch方案同期化处理的荷斯坦弗里西亚青年母牛或泌乳奶牛体内。在同期化发情后第35天通过经直肠超声进行妊娠诊断，并在第63天进行确认。妊娠丢失（PL）定义为第35天至第63天之间的丢失。记录所得犊牛（n = 21）及同期通过人工授精（AI）获得的犊牛队列（n = 44）的妊娠期长度（GL）、出生重（BiW）、难产率（CD）和活力评分。从部分犊牛（n = 35）采集血样，用于第0天的血液学分析以及第0天和第14天的生化分析。有证据表明，在LOPU前经历过健康事件的供体，其产生的囊胚数量（0.3 vs 2.1）和囊胚率（假定合子形成囊胚的百分比；0.8% vs 15.1%）均低于未经历健康事件的供体。血浆抗缪勒管激素（AMH）浓度处于最低25%类别的供体，其回收的卵母细胞数量少于中间50%类别的供体，而后者回收的卵母细胞数量又低于最高25%类别的供体（分别为3.9、8.1和26.9）。血浆AMH浓度处于最低25%类别的供体，其产生的可移植胚胎数量少于中间50%和最高25%类别的供体（分别为0.6、1.1和4.4）。第21天妊娠特异性蛋白B（PSPB）的平均血清浓度在第35天被诊断为未怀孕的受体中最低（0.16 ng/mL），而在维持妊娠至足月的受体中最高（0.96 ng/mL）。AI来源与JIVET来源犊牛的妊娠期长度和出生重相似。难产率和犊牛活力评分不受犊牛来源影响。结论：LOPU前供体犊牛的健康状况和血浆AMH浓度与随后的胚胎产量相关，且JIVET来源犊牛的GL、BiW、CD和犊牛活力评分与AI来源犊牛相似。 解读性摘要： 在育种计划中利用辅助生殖技术（ART）生产优良后代现已广泛普及。幼畜体外受精与胚胎移植（JIVET）涉及从青春期前供体生产胚胎，可通过显著缩短世代间隔来加快遗传进展。本研究证明，JIVET可在季节性放牧奶牛体系的限制条件下用作推进遗传进展和产出优良后代的手段。

论文解读

一、研究背景与目的

奶牛育种计划中遗传进展速率的主要影响因素包括选择强度、选择准确性、遗传变异以及世代间隔。其中，世代间隔是制约遗传进展的重要瓶颈。辅助生殖技术（ART），如超数排卵与胚胎移植以及体外胚胎生产（IVP），可通过提高母系选择强度来加速遗传进展，使单个优良母畜产生比常规育种策略更多的后代。过去十年间，IVP的使用显著增加；2024年，移植的IVP胚胎数量（超过142万枚）是体内来源胚胎（274,334枚）的5倍。由于基因组选择的进步，基因优良的母畜可在出生时即被识别，并可从2月龄起纳入育种计划。这一过程被称为幼畜体外受精与胚胎移植（JIVET），涉及从青春期前雌性供体生产胚胎，具有通过"从犊牛产生犊牛"的方式显著缩短世代间隔的潜力，使优良母畜在自身达到青春期前即可拥有多个后代。

然而，从青春期前犊牛采集的卵母细胞其体外发育潜力低于青春期后母畜的卵母细胞。尽管外源促性腺激素可诱导大量卵泡发育，但在动物达到6至8月龄之前，其所含卵母细胞的发育能力较差。此外，与成年供体来源的胚胎相比，青春期前供体来源的胚胎在胚胎移植后的妊娠率（P/ET）较低，这在瘤牛和普通牛品种中均有报道。

在季节性放牧奶牛体系中，牛群繁殖性能是盈利能力的关键驱动因素。由于配种季节内母牛怀孕的时间窗口较短，任何损害每次配种妊娠率的繁殖策略在季节性奶牛体系中都是不可取的。季节性体系中的另一个挑战是胚胎移植受体的可用性，受体通常在配种季节开始时才可获得。大多数奶牛母犊在1月中旬至2月底之间出生，因此在配种季节开始时，潜在的供体犊牛年龄为2至4月龄。基于这些限制，本初步研究的目标是检验JIVET在季节性放牧奶牛体系中的潜在应用，并为优化JIVET性能和设计未来研究提供供体与受体性能方面的见解。此外，研究人员假设AI来源的犊牛与JIVET来源的犊牛相比，整体健康和活力状况更好。

二、主要技术方法

研究人员从4个研究牛群中选取49头基因优良的荷斯坦弗里西亚犊牛作为供体，这些犊牛基于经济育种指数（EBI）和年龄入选，处于2024年春季出生的全国奶牛犊牛群体的前2%。在LOPU前，供体犊牛接受全面的健康检查，包括肺听诊评分、咳嗽评分、眼评分、耳评分和粪便评分，并记录直肠温度。供体犊牛在LOPU前36 h和24 h接受促卵泡激素（FSH）处理。LOPU由同一技术人员对每头供体犊牛实施一次，采用全身麻醉，通过腹腔镜抽吸卵泡液。采集的卵母细胞经体外成熟（IVM）后，与来自8头经证实生育力良好的公牛精子库的冷冻-解冻X分选精液进行体外受精（IVF），随后进行7天体外培养（IVC）。产生的囊胚以新鲜状态移植至位于4个牛群的同期化处理的荷斯坦弗里西亚青年母牛（n = 77）和泌乳奶牛（n = 10）体内。受体采用孕酮-Ovsynch方案进行同期化处理，青年母牛和奶牛方案略有差异。妊娠诊断在第35天通过经直肠超声进行，并在第63天确认。犊牛出生后记录妊娠期长度（GL）、出生重（BiW）、难产率（CD）和活力评分，并对部分犊牛采集血样进行血液学和生化分析。

三、研究结果

AMH、卵母细胞回收与胚胎发育： 供体犊牛血浆AMH浓度与回收卵母细胞数量之间存在显著关联（P < 0.0001）。血浆AMH浓度处于最低25%类别的供体，其回收卵母细胞数量少于中间50%和最高25%类别的供体（平均回收卵母细胞数分别为3.9、8.1和26.9）。同样，最低25%类别供体产生的胚胎数量少于中间50%和最高25%类别（平均胚胎数分别为0.6、1.1和4.4；P = 0.0008）。值得注意的是，不同AMH类别供体之间，假定合子发育至囊胚阶段的百分比没有差异（胚胎率分别为13.6%、10.8%和17.6%，P = 0.61）。

影响卵母细胞回收和胚胎发育的因素： AI来源与ET来源供体的卵母细胞回收数量无差异（P = 0.73），不同出生牛群之间也无差异（P = 0.84）。供体年龄、体重以及FSH刺激结束至LOPU的时间间隔不影响平均卵母细胞回收数量。从出生至LOPU前一周经历过健康事件的供体，其卵裂率低于未经历健康事件的供体（+19.4%，P = 0.05），LOPU前几天有发热的供体卵裂率也较低（+25%，P = 0.01）。未经历健康事件的供体其囊胚率高于经历健康事件的供体（+14.3%，P = 0.04），肺评分正常的供体其囊胚率高于肺评分异常的供体（+12%，P = 0.02）。肺评分正常的供体比肺评分异常的供体产生更多胚胎（+1.8，P = 0.03）。

第35天和第63天每次胚胎移植妊娠率及妊娠丢失： 第35天P/ET不受胚胎等级影响（P = 0.12），但胚胎阶段对P/ET有影响趋势（P = 0.07）。第6阶段和第7阶段胚胎的P/ET高于第5阶段胚胎（分别为P = 0.05和P = 0.02）。第63天P/ET受胚胎等级影响（P = 0.04），1级胚胎与3级胚胎之间的P/ET差异为37.3个百分点。第35天至第63天之间的妊娠丢失（PL）在不同胚胎等级间有差异趋势（P = 0.09），1级胚胎的PL发生率低于2级和3级胚胎（分别为5.3%、23.1%和50.0%）。

P/ET、PL、P4与PSPB之间的关系： 第7天血清孕酮（P4）浓度与第35天P/ET之间无关系（P = 0.95）。第21天血清P4浓度在第35天被诊断为怀孕的受体中高于未怀孕的受体（P < 0.001）。第21天平均血清PSPB浓度与第35天受体妊娠状态相关（P < 0.0001）；第35天被诊断为未怀孕的受体其PSPB浓度最低，维持妊娠至足月的受体浓度最高（0.16 vs 0.96 ng/mL）。第21天PSPB类别对第35天（P < 0.001）和第63天（P < 0.001）的P/ET有整体效应。最高25%PSPB类别的受体，其第35天和第63天怀孕的估计比值比（95% CI）分别为中间50%类别的14.34（3.87, 78.82）和14.93（4.37, 65.51）倍。最低25%PSPB类别的受体，其怀孕的估计比值比分别为中间50%类别的0.039（<0.001, 0.32）和0.060（<0.001, 0.50）倍。

GL、BiW、CD、犊牛活力评分： AI与JIVET来源犊牛的GL无差异（P = 0.85），初产与经产母畜所产犊牛的GL也无差异（P = 0.53）。AI来源犊牛的BiW有低于JIVET来源犊牛的趋势（?2.1 kg，P = 0.09），初产母畜所产犊牛的BiW低于经产母畜所产犊牛（+5.3 kg，P < 0.0001）。AI与JIVET来源犊牛的CD无差异（OR = 1.36；95% CI = 0.39, 4.78；P = 0.61）。犊牛来源对胎粪污染、肿胀、运动、黏膜和反应性等活力评分无影响（所有P > 0.46）。

血液生化： 14项生化变量中有12项在AI与JIVET来源犊牛之间无差异。AI来源犊牛的白蛋白浓度高于JIVET来源犊牛（+1.9 g/L，P = 0.01），而肌酸激酶浓度低于JIVET来源犊牛（?64.7 U/L，P = 0.04）。经Benjamini–Hochberg多重检验校正后，犊牛来源或来源×日龄交互作用对任何生化变量均无显著效应，但日龄对14项变量中的11项仍然显著。

血液学： 16项血液学变量中有10项在AI与JIVET犊牛之间无差异。AI来源犊牛的红细胞（RBC）计数高于JIVET来源犊牛（+1.1×10¹²/L，P = 0.0034）。AI来源犊牛的平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白（MCH）低于JIVET来源犊牛（分别为P = 0.005和P = 0.0002）。AI来源犊牛的红细胞分布宽度（RDW）高于JIVET来源犊牛（+2.4%，P < 0.0001）。AI来源犊牛的网织红细胞计数低于JIVET来源犊牛（?2.0，P = 0.04）。经多重检验校正后，16项血液学变量中有4项的犊牛来源效应仍然显著。

第14天体重和平均日增重： 第14天体重的AI与JIVET犊牛之间无差异（42.3 ± 0.58 vs 43.5 ± 0.81，P = 0.21）。AI与JIVET犊牛的平均日增重（ADG）相似（0.60 ± 0.03 vs 0.54 ± 0.05，P = 0.24），但初产母畜所产犊牛的ADG低于经产母畜所产犊牛（0.65 ± 0.03 vs 0.49 ± 0.05 kg/d，P = 0.0045）。

四、讨论与结论

本初步研究的主要发现包括：（1）从出生至LOPU前一周经历过健康事件或在LOPU当周出现任何临床症状的供体犊牛，其卵母细胞回收和胚胎发育较差；（2）卵母细胞回收和囊胚产生数量与血浆AMH浓度相关；（3）胚胎等级和发育阶段与妊娠结局相关；（4）第21天平均PSPB浓度与第35天和第63天的P/ET相关；（5）JIVET和AI犊牛的GL、BiW、CD和围产期犊牛健康与活力指标相似。

研究结论表明，供体犊牛在LOPU前的健康状况和血浆AMH浓度与随后的胚胎产量相关，AMH浓度可作为供体选择的潜在指标。JIVET来源犊牛在GL、BiW、CD和犊牛活力评分方面与AI来源犊牛相似，表明JIVET在季节性放牧奶牛体系中可作为推进遗传进展和产出优良后代的有效手段。本研究为初步探索性研究，样本量由可行性决定，统计检验为探索性解释，效应量和置信区间为未来前瞻性、有充分检验效能的研究设计提供依据。