《European Journal of Plant Pathology》：Lack of evidence of culturable Phytophthora in naturally regenerated European beech seedlings and seeds
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土壤传播的疫霉属（*Phytophthora*）卵菌在欧洲山毛榉（*Fagus sylvatica*）林中日益受到关注，其可损害根系并导致树木衰退。由于疫霉（*Phytophthora*）接种体可在土壤中持续存在且一旦建立便难以根除，受影响林分中自然更新的幼苗
土壤传播的疫霉属（*Phytophthora*）卵菌在欧洲山毛榉（*Fagus sylvatica*）林中日益受到关注，其可损害根系并导致树木衰退。由于疫霉（*Phytophthora*）接种体可在土壤中持续存在且一旦建立便难以根除，受影响林分中自然更新的幼苗在早期发育阶段可能面临感染风险。同时，自然更新可降低与种植苗圃苗木相关的一些生物安全风险，而苗圃苗木是公认的疫霉（*Phytophthora*）传播途径。然而，尽管疫霉（*Phytophthora*）已在成熟山毛榉林分和森林苗圃中得到广泛研究，但对于自然更新的山毛榉幼苗在先前受侵染森林中建立的最早阶段是否会被感染，目前所知甚少。研究人员通过检查从瑞典南部一个有疫霉（*Phytophthora*）记录的保护性山毛榉林中采集的自然更新山毛榉幼苗和山毛榉种子所关联的可培养真菌和卵菌，来回应这一问题。幼苗状况通过根部和叶片症状进行评估，从幼苗根部和种子经选择性培养基培养获得的分离物通过ITS rDNA测序进行鉴定。根部病斑较为常见，但无论从幼苗根部还是种子中均未分离到可培养的疫霉（*Phytophthora*）。相反，幼苗根部获得361个分离物，以常见的土壤和根系相关真菌为主，包括*Clonostachys* sp.、*Metapochonia bulbillosa*和*Aspergillus* sp.，表明尽管未分离到疫霉（*Phytophthora*），仍存在多样化的可培养真菌。种子获得73个分离物，其中34条ITS序列代表11个分类单元，主要为*Linnemannia*、*Fusarium*和*Clonostachys*类群。需要进一步采用分子方法的研究来阐明疫霉（*Phytophthora*）是否以低水平持续存在，或者其他土壤真菌是否在早期更新阶段更为持久。
**一、研究背景与科学问题**
土壤传播的疫霉属（*Phytophthora*）卵菌是全球森林健康的主要威胁之一，其寄主范围广、可在土壤和水中长期存活，并可通过植物贸易等途径远距离传播。欧洲山毛榉（*Fagus sylvatica*）作为易感寄主，近年来在中欧多地区出现活力下降，表现为冠层脱叶、生长减缓、根部和根颈腐烂及茎干流脂性溃疡等症状。多个疫霉（*Phytophthora*）分类单元已从受影响的山毛榉林分中分离得到。在瑞典南部——欧洲山毛榉分布的北缘——土壤传播的疫霉（*Phytophthora*）正引起生态价值较高的山毛榉林过早死亡，更新成功与否成为突出问题。
尽管疫霉（*Phytophthora*）在成熟林分和苗圃系统中已被广泛研究，但自然更新的幼苗在先前受侵染林分中建植的最早阶段是否会被感染，尚未得到充分认识。以往研究表明，受疫霉（*Phytophthora*）侵染的自然更新山毛榉幼苗可出现猝倒、根腐和根颈腐及快速衰退；控制条件下也证实了山毛榉幼苗对疫霉（*Phytophthora*）引起的根腐具有固有的敏感性。然而，直接针对自然更新幼苗和种子中疫霉（*Phytophthora*）携带情况的研究仍然有限。
本研究旨在评估土壤疫霉（*Phytophthora*）感染向自然更新山毛榉幼苗的潜在传递。研究假设：（1）疫霉（*Phytophthora*）存在于先前受侵染林分中自然更新山毛榉幼苗的根部；（2）从有疫霉（*Phytophthora*）记录地点采集的山毛榉种子可能携带可培养的疫霉（*Phytophthora*）繁殖体。该研究为疫霉（*Phytophthora*）发生后北部山毛榉林的更安全和可持续更新策略设计提供依据。
**二、研究结论与意义**
研究结果表明，尽管采样林分有明确的疫霉（*Phytophthora*）记录，但在所采用的选择性培养条件下，未从任何幼苗根部或种子样本中分离到疫霉（*Phytophthora*）。这一阴性结果不支持研究假设，即不支持在采样幼苗根部频繁通过培养方法回收疫霉（*Phytophthora*）的预期。该结果与波兰一项野外研究形成对比——后者从自然更新山毛榉幼苗中广泛分离到*Phytophthora plurivora*，而这一物种也曾在本次研究地点被检出。研究之间的差异可能与幼苗发育阶段、采样策略、环境条件（如季节性、降水和土壤湿度）以及空间异质性有关。此外，较年长且已建立的幼苗可能代表一个存活子集，活跃的可培养感染在该子集中出现频率较低或分布更分散；根部病斑也可能反映过去感染、非生物损伤或次生定植，而非正在进行的疫霉（*Phytophthora*）感染。
该研究的意义在于：不能将培养法未回收疫霉（*Phytophthora*）解释为该病原在采样地点或组织中完全不存在。由于未对根部和种子组织进行直接分子检测，低丰度、不可培养或空间上局部的感染可能未被检测到。因此，研究结果证明的是在所应用的培养条件下从采样幼苗根部和种子中未回收可培养疫霉（*Phytophthora*），而非病原体在林分中的真正缺失。从应用角度看，疫霉（*Phytophthora*）受影响山毛榉林分的更新规划不应仅基于病原体直接传入种子的假设，也不应期望自然更新幼苗中存在广泛的、可检测到的感染。
**三、主要关键技术方法**
研究样本采集自瑞典南部S?der?sen国家公园（56.0167° N, 13.2167° E）一个约120年生、以自然保护为主要管理目标的山毛榉林，该地此前已确认存在*Phytophthora cambivora*和*P. plurivora*。2019年9月采集91株3年生自然更新幼苗；2020年3月从两个地点（有疫霉记录P+和无疫霉记录P-）各采集15颗种子。关键技术方法包括：（1）采用PARPN–V8半选择性培养基从幼苗细根和种子中分离疫霉（*Phytophthora*）及其他可培养微生物；（2）基于根部菌落形态将分离物归为37个形态型，种子分离物不预先分组；（3）利用ITS4/ITS6引物扩增核糖体DNA内转录间隔区（ITS rDNA），通过Sanger测序获取序列；（4）使用MAFFT v7进行多序列比对，MEGA 7检查和优化比对，raxmlGUI 2.0基于最大似然法构建系统发育树（GTR+GAMMA模型，1000次bootstrap重复）；（5）在R环境中使用vegan、dplyr、tidyr和ggplot2包进行统计分析和群落分析。
**四、研究结果**
**（一）幼苗根部可培养真菌和卵虫菌**：所有91株幼苗的根部样本均长出丝状菌丝体，共获得361个真菌分离物，基于ITS系统发育分析和GenBank参考序列比对归为19个真菌分类单元。根际可培养真菌群落以*Clonostachys* sp.（与*C. rosea*和*C. solani*有亲缘关系）占优势（32.8%），其次为*Metapochonia bulbillosa*（18.0%）和*Aspergillus* sp.（11.5%），其余分类单元分离频率均≤3.3%。优势类群主要呈现腐生或根际相关的生态型，其中*Clonostachys* spp.以重寄生活性著称。
**（二）幼苗状况与症状**：幼苗平均高度为13.8（±6.5）cm，平均茎直径为2.63（±1.01）mm。视觉检查显示，9.9%幼苗出现褪绿，86.8%出现轻度叶斑，63.7%出现坏死症状，94.5%根部观察到菌根结构，45.1%幼苗可见根部病斑。Spearman相关分析显示，幼苗高度与茎直径呈强正相关（ρ=0.87，p<0.001），健康指数与根部病斑存在相关（ρ=0.71，p<0.001），但该相关部分由指数构建方式决定。具有根部病斑的幼苗健康指数中位数为3，无根部病斑的幼苗中位数为2（Wilcoxon秩和检验，W=256，p<0.001）。个体症状之间的两两相关性较弱（|ρ|≤0.12，p≥0.270），表明根部病斑、褪绿/叶斑和坏死并未一致共现。
**（三）种子可培养真菌和卵虫菌**：30颗供试种子中有19颗长出可培养真菌，总体定植频率为63.3%。P-地点种子定植频率（73.3%）高于P+地点（53.3%），但差异不显著（Fisher精确检验，p=0.4497）。共从种子中获得73个真菌分离物，经分子鉴定归属11个真菌分类单元。最常分离到的分类单元为*Linnemannia gamsii*（29.41%），其次为*Fusarium* sp. 2（与*F. solani*有亲缘关系，17.65%）以及*Clonostachys* sp.和*L. hyalina*（各14.71%）。*Mucor laxorrhizus*、*Podila humilis*和*Cylindrodendrum alicantinum*仅从P+种子中分离到，而*Entomortierella parvispora*、*Fusarium* sp. 1和*Mortierella* sp.仅从P-种子中分离到。种子间分类单元重叠有限（合并Jaccard相似度=0.27），但两组间群落组成差异不显著（PERMANOVA：R2=0.05591，F=1.0067，p=0.398）；每颗种子的物种丰富度在P+与P-之间无显著差异（Wilcoxon秩和检验，p=0.745）。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，未回收疫霉（*Phytophthora*）不应被解读为完全不存在。培养法可能无法回收低丰度或空间上分散的繁殖体；直接分子检测在本研究中未进行，因此低丰度、不可培养或局部感染可能未被发现。与波兰研究的差异可能源于幼苗发育阶段、采样策略和环境条件的不同——波兰研究在数天强降水后采集了有明显病害的幼苗，而湿润条件有利于疫霉（*Phytophthora*）游动孢子的释放和侵染。根部病斑的普遍存在提示，根损伤可能反映环境胁迫与次生或机会性定植的交互作用，而非单一优势病原的独立作用。*Clonostachys rosea*作为已知的生防真菌，其高回收率也提示拮抗真菌可能与疫霉（*Phytophthora*）在根际环境中相互作用，但这未在本研究中得到验证。种子上未检出疫霉（*Phytophthora*）支持种子内部侵染不太可能的观点，但表面灭菌处理不排除病原在种子表面或附着的土壤有机质中外部携带的可能。种子与幼苗根部的可培养真菌群落组成存在差异，表明不同生活史阶段和组织的可培养真菌组成有所不同。
结论部分可翻译为：从应用角度来看，综合研究结果表明，在受疫霉（*Phytophthora*）影响的山毛榉林分中进行更新规划，不应仅基于病原直接传入种子的假设，也不应期望自然更新幼苗中存在广泛的可检测感染。数据揭示了一个更复杂的自然更新环境，其中根系健康、更广泛的微生物互作及其动态变化以及环境胁迫可能起决定性作用。在所应用的条件下，表面消毒种子中缺乏可培养疫霉（*Phytophthora*）的证据，值得进一步研究基于种子的自然更新作为一种潜在具有生物安全意识的更新策略。未来研究应将基于培养的分离方法与物种特异性qPCR和根、种子及相关土壤的宏条形码（metabarcoding）相结合，配合重复的季节性采样和土壤诱饵法。这种方法将提高对低丰度或时空变化型疫霉（*Phytophthora*）的检测能力，而培养和诱饵法将保留有活力繁殖体的证据。
