迷迭香（Salvia rosmarinus）中新型二萜类化合物的发现：具有抗增殖与抗氧化活性的18-羟基鼠尾草酚

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Novel Diterpenoids From Salvia rosmarinus Reveal a Compound With Antiproliferative and Antioxidant Activities

　　

从迷迭香（Salvia rosmarinus）叶片中分离得到四种此前未被描述的二萜类化合物（1–4），并鉴定为18-羟基鼠尾草酚（18-hydroxycarnosol，1）、18-乙酰氧基迷迭香酚（18-acetoxyrosmanol，2）、18-乙酰氧基鼠尾草酚（18-acetoxycarnosol，3）和18-乙酰氧基-7-O-甲基迷迭香酚（18-acetoxy-7-O-methylrosmanol，4）。此外，还分离得到九种已知化合物，包括鼠尾草酚（carnosol，5）、迷迭香酚（rosmanol，6）、7-O-甲基金合欢素（7-O-methylacacetin，7）、鼠尾草苷元（salvigenin，8）、地蜡菊素（hispidulin，9）、蓟黄素（cirsimaritin，10）、(1S,4S)-对-薄荷-2-烯-1,4-二醇（11）、3,4,5-三甲氧基肉桂醇（12）和香草酸（vanillic acid，13）。新化合物的结构主要通过一维和二维核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）实验以及实时直接分析高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry by direct analysis in real time technique，HRMS DART）分析确定。化合物1和2的绝对构型通过DP4+分析和实验电子圆二色谱（electronic circular dichroism，ECD）与理论计算光谱的比较确定。研究人员针对一组癌细胞系和一个正常细胞系评估了抗增殖活性。化合物1和5对白血病细胞系K562的半数抑制浓度（IC50）分别为10.77?±?1.4和10.19?±?0.4?μM，对非癌性细胞系COS-7的IC50分别为25.27?±?2.5和37.40?±?3.7?μM。化合物7对胶质母细胞瘤细胞系U251的IC50为9.36?±?0.1?μM，对前列腺癌细胞系PC-3的IC50为15.21?±?1.7?μM。化合物1的抗氧化活性通过其清除2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力以及硫代巴比妥酸反应物质（Thiobarbituric Acid Reactive Substances，TBARS）法测定脂质过氧化抑制作用来评估，IC50分别为25.50?±?0.29和6.51?±?0.09?μM。这些结果凸显了S. rosmarinus作为进一步化学和生物学研究对象的的重要性。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

鼠尾草属（Salvia L.）是唇形科（Lamiaceae）中最大的属，包含约1000个物种，分布几乎遍及全球，具有观赏、烹饪、药用甚至致幻等多种用途。该属的分类学问题长期存在争议，两项系统发育与分类学支持的提案被提出以应对该属的复杂性和多系性：一项由Drew等人提出，将Dorystaechas、Meriandra、Perovskia、Rosmarinus和Zhumeria等小属并入Salvia属；另一项由Will和Cla?en-Bockhoff提出，建议将Salvia L.划分为六个属。目前多个国际数据库已采纳Drew等人的提案，因此在本研究中，Rosmarinus officinalis被视为S. rosmarinus Penn.的同物异名。

从植物化学角度而言，二萜类化合物被认为是Salvia属的特征性次生代谢产物，广泛应用于化学分类学研究。在旧大陆Salvia物种中，松香烷型（abietane）二萜占主导地位，尤其在土耳其和中国的物种中展现出显著的结构多样性。化学分类学研究还表明，多个Salvia物种与若干相关小属之间存在密切的植物化学联系，鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酚等化合物已在Dorystaechas、Meriandra、Perovskia、Zhumeria和Rosmarinus officinalis（即S. rosmarinus）中被鉴定。

迷迭香（S. rosmarinus）是一种原产于地中海地区的芳香多年生灌木，因其药用特性和烹饪用途被广泛栽培。其精油、提取物和分离化合物已被报道具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、神经保护、抗糖尿病、抗肥胖、抗抑郁和认知增强等作用。然而，该物种的化学成分受环境和物候因素、采集日期、栽培状态和地理来源的影响而变化，因此对不同种群的系统研究仍然必要。本研究旨在分析墨西哥城郊区栽培的S. rosmarinus种群，寻找具有生物活性的二萜类化合物。

二、研究内容与主要发现

研究人员从S. rosmarinus叶片的CH₂Cl₂提取物中分离得到四个此前未报道的二萜类化合物：18-羟基鼠尾草酚（1）、18-乙酰氧基迷迭香酚（2）、18-乙酰氧基鼠尾草酚（3）和18-乙酰氧基-7-O-甲基迷迭香酚（4），以及九个已知化合物（5–13）。新化合物的结构通过一维和二维核磁共振（NMR）实验和高分辨质谱（HRMS DART）确定。化合物1和2的绝对构型通过DP4+分析和实验电子圆二色谱（ECD）与理论计算光谱的比较确定。这是首次从S. rosmarinus中分离得到(1S,4S)-对-薄荷-2-烯-1,4-二醇（11），其绝对构型通过实验与理论ECD光谱比较确定。

研究人员评估了CH₂Cl₂提取物及化合物1、2、5、7–10和12的抗增殖活性，使用六种人类癌细胞系（U251、PC-3、K562、HCT-15、MCF-7和SKLU-1）和正常猴肾细胞（COS-7），采用磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB）法测定。化合物1和5对K562细胞系表现出较高的毒性，IC₅₀分别为10.77?±?1.4和10.19?±?0.4?μM，对COS-7的IC₅₀分别为25.27?±?2.5和37.40?±?3.7?μM，两者的选择性指数（selectivity index，SI）分别为2.35和3.67，均高于阳性对照阿霉素。化合物7对U251和PC-3细胞系表现出中等细胞毒性，IC₅₀分别为9.36?±?0.1和15.21?±?1.7?μM，但对COS-7的IC₅₀超过310?μM，显示出高选择性。

化合物1的抗氧化活性通过DPPH自由基清除实验和TBARS脂质过氧化抑制实验评估，IC₅₀分别为25.50?±?0.29和6.51?±?0.09?μM，与标准品α-生育酚（IC₅₀分别为24.97?±?1.11和6.78?±?2.16?μM）相当。值得注意的是，在TBARS实验中，化合物1在较低浓度下比α-生育酚更有效。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：高场核磁共振（NMR）波谱学（700 MHz一维和二维NMR实验）结合高分辨质谱（HRMS DART）进行结构鉴定；密度泛函理论（density functional theory，DFT）计算结合DP4+概率方法确定相对构型；含时自洽场（TD-SCF）方法在PBEPBE/6-311G++(2d,2p)理论水平计算电子圆二色谱（ECD）光谱并与实验光谱比较以确定绝对构型；磺酰罗丹明B（SRB）比色法评估抗增殖活性；DPPH自由基清除实验和TBARS实验评估抗氧化活性。植物材料采集自墨西哥城Milpa Alta市栽培种群，凭证标本（voucher 186695）存放于墨西哥国立自治大学（UNAM）理学院标本馆（FCME）。

四、研究结果

4.1 结构解析

化合物1（18-羟基鼠尾草酚）为黄色粉末，HRMS（DART）显示准分子离子[M?+?H]⁺在m/z 347.1857（计算值C₂₀H₂₇O₅，347.1859）。红外光谱显示O–H伸缩振动（3379?cm^?1）、芳香C═C伸缩振动（1628和1583?cm^?1）和δ-内酯C═O伸缩振动（1711?cm^?1）。紫外光谱在225和285?nm处有吸收，为11,12-二羟基松香烷-8,11,13-三烯骨架的典型特征。通过DP4+分析确定其相对构型为4R,5S,7S,10R，概率为100.0%，ECD光谱与计算数据吻合，确定绝对构型为(4R,5S,7S,10R)。

化合物2（18-乙酰氧基迷迭香酚）为黄色粉末，HRMS（DART）显示[M?+?H-H₂O]⁺在m/z 387.1803（计算值C₂₂H₂₇O₆，387.1808）。NMR数据与化合物1显著相似，但含有γ-内酯和乙酰氧基。DP4+分析确定相对构型为4R,5S,6S,7S,10R，概率为99.98%，ECD光谱与计算数据吻合，确定绝对构型为(4R,5S,6S,7S,10R)。

化合物3（18-乙酰氧基鼠尾草酚）和4（18-乙酰氧基-7-O-甲基迷迭香酚）以83:17的混合物形式分离。化合物3的NMR数据与1相似，区别在于C-18位连接乙酰氧基。化合物4的NMR数据与2相似，区别在于C-7位连接甲氧基。化合物4与从Salvia africana-lutea中分离的化合物14密切相关，唯一区别在于C-4位立体中心的构型。

4.2 抗增殖与抗氧化活性

CH₂Cl₂提取物在25.0?μg/mL浓度下对六种人类癌细胞系中的五种（PC-3、K562、HCT-15、MCF-7和SKLU-1）表现出超过50%的增殖抑制活性，对MCF-7和SKLU-1的抑制率最高，分别为62.37%和62.21%。化合物1和5对K562细胞系表现出高毒性，对COS-7细胞系毒性较低。化合物7对U251和PC-3细胞系表现出细胞毒性。化合物1的DPPH自由基清除IC₅₀为25.50?±?0.29?μM，与α-生育酚（24.97?±?1.11?μM）几乎相同，约为槲皮素（7.86?±?0.26?μM）活性的三分之一。化合物1的TBARS实验IC₅₀为6.51?±?0.09?μM，约为槲皮素（1.496?±?0.031?μM）活性的四分之一，与α-生育酚（6.78?±?2.16?μM）几乎相同。在10.00和31.62?μM浓度下，化合物1抑制脂质过氧化分别为88.84%和94.09%，而α-生育酚分别为59.00%和72.30%。

五、结论

本研究从栽培的S. rosmarinus种群的CH₂Cl₂提取物中分离得到多种天然产物，包括四个未发表的二萜类化合物：18-羟基鼠尾草酚（1）、18-乙酰氧基迷迭香酚（2）、18-乙酰氧基鼠尾草酚（3）和18-乙酰氧基-7-O-甲基迷迭香酚（4），以及九个已知化合物（5–13）。化合物1和2的绝对构型被确定为(4R,5S,7S,10R)和(4R,5S,6S,7S,10R)。化合物1和5对K562白血病细胞系表现出中等抗增殖活性（IC₅₀分别为10.77和10.19?μM），对非癌性COS-7细胞系活性较低（IC₅₀分别为25.27和37.40?μM），两者的选择性指数均高于阳性对照阿霉素。化合物7对U251和PC-3细胞系表现出中等抗增殖活性（IC₅₀分别为9.36和15.21?μM），但对COS-7的选择性极高（IC₅₀超过310?μM）。化合物1在DPPH和TBARS实验中的抗氧化活性与标准品α-生育酚相当，且在TBARS实验中于较低浓度下比α-生育酚更有效。本研究结果补充了众多关于S. rosmarinus的研究，再次确认该药用植物作为生物活性化合物重要来源的地位，并强调其作为化学和生物学研究对象的的重要性。