基于创新性ARMS-qRT-PCR技术的传染性法氏囊病病毒快速鉴定与鉴别检测研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Rapid Identification and Differential Detection of Infectious Bursal Disease Virus by an Innovative ARMS-qRT-PCR Assay

　　

传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起，对家禽业构成重大威胁，多种基因型毒株的共循环使诊断与防控复杂化。由于不同基因型之间的抗原性差异及其与常用疫苗株之间的差异，快速而准确的鉴定和鉴别检测对于IBDV的监测与防控至关重要。本研究开发了一种新型扩增阻滞突变系统定量逆转录PCR（amplification refractory mutation system quantitative reverse transcription PCR，ARMS-qRT-PCR）检测方法，用于对目前在中国及其他一些国家广泛共循环的超强毒IBDV（very virulent IBDV，vvIBDV）、新型变异IBDV（novel variant IBDV，nvIBDV）和弱毒IBDV（attenuated IBDV，attIBDV）进行快速鉴别诊断。通过将ARMS技术与qRT-PCR相结合，该方法能够准确区分这些基因型，包括共感染样本。所建立的ARMS-qRT-PCR检测方法显示出高度的可重复性和特异性，在三种基因型之间以及与其他常见禽类病原体之间均无交叉反应。该检测方法具有高灵敏度和优异的线性相关性，对vvIBDV、nvIBDV和attIBDV的检测限分别为65.6、57.8和70.2 copies/μL。在识别单一和共感染临床样本方面，其结果与测序验证完全一致。重要的是，该方法成功识别并定量了复杂的双重和三重共感染病例中各个基因型的差异检出。这种高通量、用户友好的方法与传统技术相比具有显著优势，是IBDV实时诊断、流行病学监测和疫情暴发管理的理想工具。

传染性法氏囊病（IBD）是严重威胁全球家禽业的高度接触性免疫抑制性疾病，其病原为传染性法氏囊病病毒（IBDV），主要破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致感染后免疫抑制和继发感染。当前中国及部分国家流行毒株以超强毒IBDV（vvIBDV）、新型变异IBDV（nvIBDV）和弱毒IBDV（attIBDV）为主，且不同致病型可共循环，长期共感染为病毒快速演化提供条件，给疾病防控造成重大挑战。由于不同基因型间抗原性差异及其与常用疫苗株差异，传统检测方法（如RT-PCR测序、多重RT-PCR、TaqMan qRT-PCR、RT-PCR-RFLP、HRM-qRT-PCR、基因芯片、核酸杂交和数字PCR等）存在耗时长、成本高、操作复杂或无法对共感染中单个病毒独立定量等局限。因此，急需开发一种可快速、准确鉴别当前流行vvIBDV、nvIBDV和attIBDV并能在共感染样本中分别定量的新方法。研究人员将扩增阻滞突变系统（ARMS）技术与qRT-PCR结合，创新性地建立了ARMS-qRT-PCR检测方法，实现了三种IBDV基因型的同步鉴别与定量。该方法采用三对基因型特异性ARMS引物，分别针对vvIBDV、nvIBDV和attIBDV的稳定特征性核苷酸位点，通过优化退火温度实现特异性扩增；具有灵敏度高、特异性强、可重复性好、操作简便和闭管检测等优点，尤其适用于共感染样本的鉴别诊断和大规模流行病学监测。临床评价显示，该方法对人工感染和临床样本的检测结果与测序验证完全一致，可用于单一、双重和三重共感染样本的准确识别与定量，为IBDV的实时诊断、暴发管理和防控策略制定提供了理想工具。

研究人员开展本研究主要采用以下关键技术方法：从NCBI数据库获取并比对442条IBDV完整基因组A片段序列，筛选稳定且具有基因型特征的单核苷酸多态性位点，设计了三对ARMS特异性引物和一对通用引物；构建三种重组标准质粒（pMD-vv、pMD-nv、pMD-att）作为阳性标准品；通过梯度退火温度试验确定各引物的最优反应条件；利用10倍梯度稀释的标准质粒建立标准曲线并评估灵敏度和检测限；以常见禽类病原体（IBV、NDV、REV、aHEV、AIV、aMPV、ALV、MDV、ILTV、FAdV-4）验证特异性；通过批内和批间重复试验评估重复性。样本队列来源包括：40只未接种疫苗的三黄鸡（28日龄）随机分为8组，分别进行vvIBDV、nvIBDV、attIBDV单一感染，两两双重感染及三重共感染，另设PBS对照组，于感染后7天采集法氏囊组织；另外包括10份经测序鉴定的临床样本（5份vvIBDV、2份nvIBDV、3份attIBDV）。

主要研究结果如下：

**3.1 代表性IBDV不同基因型中的独特突变**。通过比对筛选442条IBDV全长基因组序列，在A片段第670、685、794和937位点鉴定出不同基因型的独特核苷酸突变，并据此设计了相应的ARMS引物，为基因型特异检测提供了靶点。

**3.2 针对不同基因型ARMS引物退火温度的确定**。通过RT-PCR梯度试验确定：ARMS-vvIBDV引物最适退火温度为60°C，仅扩增pMD-vv；ARMS-nvIBDV引物最适退火温度为58°C，仅扩增pMD-nv；ARMS-attIBDV引物最适退火温度为60°C，仅扩增pMD-att。表明各引物在各自最优温度下可实现单基因型特异性扩增。

**3.3 ARMS-qRT-PCR的灵敏度与标准曲线**。使用10倍梯度稀释的三种标准质粒（10¹⁰～10¹ copies/μL）进行检测，所有稀释度均获得100%阳性检出率。vvIBDV、nvIBDV和attIBDV的检测限分别为65.6、57.8和70.2 copies/μL，标准曲线显示初始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系（R²分别为0.9988、0.9997和0.9993），扩增效率分别为104.3%、95.5%和100.1%，证实该检测方法敏感性高、定量准确。

**3.4 ARMS-qRT-PCR的特异性分析**。在优化条件下，用三对ARMS引物检测一系列常见禽类病原体（IBV、NDV、REV、aHEV、AIV、aMPV、ALV、MDV、ILTV、FAdV-4）及ddH₂O阴性对照，仅IBDV三种基因型样本出现扩增曲线，其余病原体和阴性对照均无扩增，表明该方法对三种IBDV基因型具有高度特异性。

**3.5 ARMS-qRT-PCR的重复性检验**。采用三种标准质粒10倍梯度稀释（10⁸～10⁴ copies/μL）进行批内和批间重复试验，结果显示pMD-vv、pMD-nv和pMD-att的Ct值变异系数（CV）批内为0.21%～0.51%，批间为0.22%～1.15%，说明方法重复性好、结果稳定。

**3.6 ARMS-qRT-PCR对实验感染鸡和临床样本中IBDV的鉴定与基因分型**。对40只人工感染鸡的法氏囊样本进行检测，ARMS-qRT-PCR检出35份阳性、5份阴性，结果与常规套式RT-PCR联合测序结果完全一致，无假阳性和假阴性。对10份独立测序确认的临床样本（vvIBDV、nvIBDV和attIBDV）的检测，全部正确区分，与测序结果符合率为100%。上述结果证实该方法可准确鉴别单一、双重及三重共感染样本中的三种IBDV基因型。

讨论部分总结认为，传统基因分型方法如RT-PCR-RFLP、TaqMan qRT-PCR、HRM-qRT-PCR等存在成本高、耗时长或无法对共感染样品中单个病毒独立定量等不足；ARMS-qRT-PCR无需探针，成本低且具有高分辨能力，尤其适合共感染样品的快速筛查和定量分析。该方法在特异性、重复性和灵敏度方面均表现良好，检测限优于常规RT-PCR（约10³ copies/μL），虽然略低于传统染料法qRT-PCR（约10¹ copies/μL），但其整个扩增过程仅需约60分钟，单次运行可高通量分析32份样品，远优于传统方法。通过与HRM-qRT-PCR比较，ARMS-qRT-PCR利用等位基因特异性3‘末端引物，能够在共感染样本中同时区分并独立定量vvIBDV、nvIBDV和attIBDV，克服了后者依赖单引物对和熔解曲线鉴别而无法定量共感染中单个病毒的局限。该检测方法在人工共感染样品和临床样品中均与测序结果完全一致，即使在复杂三重共感染样本中也能准确鉴别和定量，显示出良好的临床适用性。研究结论部分翻译为：总之，本研究首次开发了一种创新的ARMS-qRT-PCR检测方法，用于vvIBDV、nvIBDV和attIBDV的快速检测和基因分型。该方法能够准确识别和区分所有单一或共感染样本，同时可对共感染中单个基因型进行定量。此外，其用户友好的操作流程和快速处理时间使其特别适用于IBDV暴发期间的实时流行病学监测。