《Molecular Oncology》：Extracellular matrix remodeling and immune reprogramming drive residual tumor progression of liver cancer after incomplete microwave ablation
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尽管微波消融（MWA）构成了肝癌的一种有效靶向治疗手段，但驱动高复发率的机制仍知之甚少。为阐明这些过程，研究人员在兔VX2肿瘤中建立了不完全微波消融（iMWA）模型，并在消融后第3天（D3）和第14天（D14）对残留肿瘤进行了蛋白质组学分析。通过整合小鼠射频消
尽管微波消融（MWA）构成了肝癌的一种有效靶向治疗手段，但驱动高复发率的机制仍知之甚少。为阐明这些过程，研究人员在兔VX2肿瘤中建立了不完全微波消融（iMWA）模型，并在消融后第3天（D3）和第14天（D14）对残留肿瘤进行了蛋白质组学分析。通过整合小鼠射频消融（RFA）模型的基因组图谱，研究人员在D3和D14分别鉴定出81个和92个上调蛋白。功能富集分析（STRING和Enrichr）显示，急性损伤反应和细胞外基质（ECM）重塑在D3时占主导，到D14时显著下降。相反，信号转导、肿瘤发生和免疫通路相关通路在D14显著上调。具体而言，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析揭示，巨噬细胞重塑和免疫检查点网络在D14功能耦联，共同塑造免疫抑制微环境。Stouffer分析证实了从早期基质重塑向晚期致癌信号转导和免疫抑制的转变。总体而言，这些发现表征了消融后残留肿瘤生长的动态机制，并强调了抑制促肿瘤通路同时增强抗肿瘤免疫的潜在治疗靶点。
肝细胞癌（HCC）等原发性肝癌位居全球肿瘤发病率第六位、肿瘤相关死因第四位。热消融对早期HCC安全有效，微波消融（MWA）自1990年代应用于临床，但直径<5 cm病灶消融后复发率约20%，更大病灶可达40%。残留肿瘤进展的机制尚不清楚，且临床活检因伦理和影像学诊断标准受限，难以在消融后最佳时间点直接分析。本研究利用兔VX2肝肿瘤模型建立不完全微波消融（iMWA）模型，在消融后第3天（D3）和第14天（D14）采集残留活肿瘤组织，结合蛋白质组学与小鼠射频消融（RFA）模型的基因组数据，旨在阐明残留肿瘤进展的分子机制。
研究采用新西兰白兔VX2肝肿瘤模型，设未治疗对照（D0, n=5）、iMWA后3天（D3, n=7）与iMWA后14天（D14, n=5）三组；以17F微波针65 W、40–60 s消融至少50%肿瘤。苏木精-伊红（H&E）染色区分坏死区与残留活肿瘤边缘后显微切割，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和DIA-NN进行蛋白质组学定量，共定量8724种蛋白。随后用STRING、Enrichr进行功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以马尔可夫聚类算法（MCL）划分功能模块，并用Stouffer分析验证通路时相转变。
3.1 消融后肝肿瘤的组织表征与蛋白质组学分析
通过大体观察和H&E染色确认消融中心坏死区、残留活肿瘤边缘和邻近肝组织，后续蛋白质组学均使用显微切割的残留活肿瘤组织。
3.2 蛋白质组学鉴定残留肿瘤中的时间动态蛋白表达
共定量8724种蛋白，与转录组重叠240个；D3 vs D0有9个上调、11个下调，D14 vs D0有12个上调、7个下调。基于STRING网络扩展后最终鉴定D3有81个、D14有92个上调蛋白。
3.3 蛋白质聚类揭示D3结构重建
D3的81个上调蛋白形成9个功能簇，以整合素介导的细胞黏附为主，富集补体/凝血级联、MHC II类抗原呈递、溶酶体组织蛋白酶、脂质代谢等；基因本体（GO）和Reactome显示细胞外基质（ECM）、胶原分解、ECM蛋白聚糖、弹性纤维形成显著富集，提示急性损伤修复和ECM重塑主导。
3.4 蛋白质聚类揭示D14肿瘤生长和免疫调节
D14的92个上调蛋白形成8个功能簇，包括肽酶M10A/赖氨酰氧化酶、细胞应答、轴突再生、ECM-受体相互作用、G1期、突触修剪，以及DNA损伤应答（CDK12、BARD1、TP63）和巨噬细胞表型（CD14、CD68、GPNMB）簇；GO富集显示细胞增殖调控、生长因子结合、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）活性等显著增加，同时正调控细胞死亡和凋亡通路也富集，提示向活跃肿瘤生长信号转变。
3.5 功能富集分析识别从早期ECM重塑向晚期免疫和致癌信号的时间转变
Enrichr通路分析显示D3以急性损伤反应（18）、补体系统（20）、ECM重塑/纤维化（27）为主；D14这些通路分别降至6、4、8，而信号转导由13升至35（如PI3K-Akt、TGF-β），肿瘤发生由5升至11，免疫功能由12升至16，血管生成由1升至6。
3.6 免疫重编程分析发现巨噬细胞功能重塑与免疫检查点信号协同耦联
D14较D3，巨噬细胞向免疫抑制表型转变的标志物（CD200、CD68、CD14、CD163、CD44、MSR1、STAT6、ITGAL、GPNMB、CD300LF）和免疫检查点调节因子（LGALS3、LGALS3BP、TGFBI、TGFBR1、CD38、CD300LF、CD200、GPNMB）均上调。STRING PPI网络显示CD44作为中心枢纽连接巨噬细胞和检查点模块，GO富集到“免疫系统过程的负调控”。
3.7 Stouffer分析证实从早期基质重塑和细胞死亡向晚期免疫激活和免疫抑制的时间转变
Stouffer分析显示细胞死亡/坏死性炎症程序在D3和D14均持续升高；纤维化重塑和EMT/祖细胞激活在D3升高后于D14降至基线以下；补体/凝血和急性期反应持续抑制；代谢重编程和内质网应激从D3抑制转为D14激活。适应性免疫方面，抗原呈递和树突细胞特征持续升高，淋巴细胞活性在D14增加，免疫检查点和耐受分子显著升高，提示D14存在免疫抑制性微环境。
讨论部分指出，残留肿瘤呈现从D3急性损伤/ECM修复为主到D14免疫抑制和信号转导增强的双相演变。早期ECM沉积可能作为启动事件，通过物理和生化屏障促进后期免疫抑制微环境。CD44作为中枢枢纽连接耐受性巨噬细胞与免疫检查点网络，负调控免疫系统。基于D14增殖特征，研究提出CDK抑制剂、CD44靶向递送以及联合免疫治疗（如抗PD-1、atezolizumab+bevacizumab）可能抑制残留肿瘤生长。磁共振弹性成像（MRE）和弹性蛋白特异成像可用于消融后无创监测。局限性包括跨物种/跨模态整合、时间点差异、VX2并非HCC、兔蛋白质组注释不全等。
总之，本研究提供了肝癌不完全消融后残留肿瘤生长相关信号和通路的分子见解。研究结果强调了消融后双相反应，包括第3天早期ECM驱动的修复和致癌信号，随后在第14天出现相对免疫抑制。因此，数据勾勒出从结构恢复向促肿瘤重编程的时间转变，这可能构成早期残留肿瘤生长的基础。理解这些序贯适应过程为优化消融后治疗提供了机制框架。将MWA与靶向激酶抑制或免疫调节策略相结合，有望破坏促进残留肿瘤生长的通路并改善肝癌长期临床结局。
