E2F3扩增使膀胱癌细胞易发生早熟有丝分裂：PKMYT1抑制的精准医学新策略

《Cancer Gene Therapy》：E2F3 amplification primes bladder cancer cells for premature mitosis

　　

专业摘要翻译： E2F–RB通路控制G1/S检查点，肿瘤常通过RB1或CDKN2A缺失绕过该检查点。与这些病变不同，E2F3扩增驱动持续的过度E2F依赖性转录贯穿S期和G2期。该癌基因在膀胱癌等多种癌症中频繁扩增，但其对癌细胞周期的影响尚不明确。研究人员利用同基因膀胱癌模型和患者数据证明，E2F3扩增过度激活有丝分裂基因表达程序（包括cyclin B1）。这使得细胞在G2/M检查点被PKMYT1抑制剂lunresertib（单独或联合低剂量WEE1抑制剂zederosertib）抑制时，易发生非程序性有丝分裂。E2F3扩增细胞通过永久性降低cyclin B1表达获得对lunresertib的耐药性，从而阻止早熟有丝分裂进入。重要的是，这种耐药性可通过联合低剂量WEE1抑制剂逆转。这些发现确定PKMYT1依赖性CDK1抑制是E2F3扩增膀胱癌细胞对抗早熟有丝分裂的关键保护机制。因此，研究人员揭示了针对G2/M检查点抑制以促进E2F3扩增且cyclin B1过表达膀胱癌患者发生灾难性有丝分裂的精准医学策略机遇。

论文解读文章：

一、研究背景与问题

在哺乳动物细胞中，CDK-RB-E2F信号通路是细胞周期进入和DNA复制的主要驱动因素。G1期时，CDK4/6-cyclin D复合物对视网膜母细胞瘤蛋白（RB）的磷酸化释放E2F激活因子（E2F1-3），使其结合靶基因启动子并上调其表达。许多E2F靶基因对G1/S转换以及DNA合成、复制和修复至关重要。正常情况下，CDK-RB-E2F轴受到严格调控以避免非程序性细胞周期进入和癌症形成。RB1和CDKN2A是常见的肿瘤抑制基因，在癌症中频繁突变或缺失；编码cyclin D或cyclin E的基因在许多癌症中扩增并作为癌基因发挥作用。虽然编码激活型E2F的基因扩增较少见，但E2F3位点扩增仍在多种癌症中观察到，尤其在肌层浸润性膀胱癌患者中频率较高，在视网膜母细胞瘤和黑色素瘤中也有较高发生率。

既往研究表明，在E2F3基因扩增的膀胱癌中敲低E2F3表达可抑制DNA复制和增殖，提示异位E2F3蛋白水平为肿瘤细胞提供生长优势。然而，缺乏使用同基因细胞系和急性E2F3过表达系统的严格对照机制研究，E2F3扩增带来的潜在治疗脆弱性可能被忽视。研究人员此前发现，在非转化上皮细胞中诱导E2F3过表达会在DNA损伤诱导后导致G2期细胞周期退出缺陷，提示E2F3扩增对增殖癌细胞的影响可能不仅限于促进S期进入。

癌基因诱导的加速S期进入和不受约束的E2F依赖性转录可能导致复制应激，引起DNA复制叉停滞和/或崩溃，造成DNA损伤和细胞周期检查点激活。面对内源性或外源性DNA损伤，增殖细胞有多种选择来延迟或停止细胞周期进程。G2/M检查点可通过WEE1激酶及相关激酶PKMYT1抑制CDK1-cyclin B复合物来阻止非程序性有丝分裂进入。这些激酶可防止CDK1过早激活以避免有丝分裂灾难。本研究旨在揭示E2F3扩增对癌细胞周期的影响及其治疗意义。

二、研究内容与结论

研究人员利用同基因细胞模型（T24、UMUC3膀胱癌细胞系及非转化RPE1-hTert细胞系，后者结合TP53敲除）引入多西环素诱导的E2F3过表达系统，系统研究了E2F3扩增对细胞周期进程的影响。研究发现，E2F3过表达导致RB磷酸化显著增加，且可被CDK2抑制剂INX-315完全阻断，而CDK4/6抑制剂palbociclib无明显效果，提示E2F3扩增可通过CDK2过度激活绕过其负调控因子RB。流式细胞术显示E2F3诱导导致G1期群体一致减少，表明G1期缩短，但并未导致增殖率增加，反而降低了所有三个细胞系的增殖率。FUCCI4活细胞成像系统追踪显示E2F3过表达缩短G1期。

E2F3过表达引起轻度和背景依赖性的复制应激信号，表现为RPA-pSer4/8、CHK1-pSer345和KAP1-pSer824激活。DNA纤维分析显示UMUC3和RPE-TP53KO细胞复制叉速度降低，而T24细胞叉速度增加，提示遗传背景依赖性复制应激表型。TCGA膀胱癌患者数据分析证实E2F3拷贝数增加患者表现出复制应激特征评分升高，以及突变负荷指标（插入缺失、单核苷酸变异和新抗原负荷）增加。

关键发现是，在测试的多种检查点激酶抑制剂中，PKMYT1抑制剂lunresertib是唯一在E2F3过表达细胞中显著更有效的药物。E2F3诱导在所有细胞系中均导致PKMYT1主要靶点CDK1-Thr14磷酸化显著增加。细胞活力实验明确证明，E2F3过表达仅在TP53突变时才使RPE细胞对PKMYT1抑制敏感，表明TP53突变和E2F3扩增的组合使细胞对PKMYT1抑制敏感，而这两种突变在肌层浸润性膀胱癌中高度共发生。

研究人员还发现，携带内源性E2F3扩增的TCCSUP和5637膀胱癌细胞对lunresertib敏感（IC50低于100 nM），且该药物通过CDK1过度激活诱导非程序性有丝分裂进入。通过逐步增加药物浓度建立耐药细胞系后，发现耐药机制并非E2F3表达沉默或药物外排增强，而是通过永久性降低cyclin B1表达来防止早熟CDK1激活和有丝分裂进入。RNA测序显示耐药细胞系中CCNB1转录本减少，蛋白水平也一致降低，且不受APC/C降解途径影响。siRNA敲低CCNB1可显著降低E2F3过表达细胞对lunresertib的敏感性，证实了cyclin B1的关键作用。

最后，研究人员发现虽然耐药细胞系对WEE1抑制剂zederosertib单药治疗敏感性未改变，但低剂量lunresertib与zederosertib联合在药物初治和耐药细胞系中均表现出强协同杀伤效应。125 nM低剂量zedoresertib联合lunresertib可克服所有耐药细胞系的耐药性，而该低剂量WEE1抑制剂单独使用不会引起显著细胞死亡。

三、主要技术方法

本研究采用同基因细胞模型系统，通过慢病毒转导在多西环素诱导系统下过表达E2F3，并结合CRISPR/Cas9敲除TP53。主要技术包括：流式细胞术分析细胞周期分布和磷酸化组蛋白H3阳性有丝分裂细胞；FUCCI4活细胞成像系统追踪各细胞周期时相持续时间；免疫印迹检测蛋白表达和磷酸化状态；DNA纤维分析测定复制叉速度；免疫荧光染色检测γH2AX和有丝分裂异常形态；MTT细胞活力测定和ZIP模型药物协同分析；RNA测序分析耐药细胞系转录组变化；以及TCGA膀胱癌队列（含61例E2F3扩增患者与341例未扩增患者）的转录组和拷贝数数据分析。

四、研究结果

E2F3过表达改变细胞周期进程：E2F3诱导导致G1期缩短，但降低增殖率。机制上，E2F3过表达通过CDK2过度激活绕过RB调控，表现为RB磷酸化增加且可被CDK2抑制剂阻断。

E2F3过表达触发背景依赖性复制应激信号：三个细胞系中观察到轻度的复制应激标志物激活，但DNA纤维分析显示不同细胞系叉速度变化方向不一致（UMUC3和RPE-TP53KO降低，T24增加），表明复制应激表型具有遗传背景依赖性。TCGA患者数据证实E2F3扩增与复制应激特征评分升高和基因组不稳定性指标增加相关。

E2F3扩增使膀胱癌细胞对PKMYT1抑制敏感：在ATR、CHK1、WEE1和PKMYT1抑制剂中，仅lunresertib在E2F3过表达细胞中显著更有效。E2F3诱导增加CDK1-Thr14磷酸化。TP53突变是E2F3过表达细胞对PKMYT1抑制敏感的必要条件。PKMYT1抑制导致E2F3过表达细胞发生有丝分裂灾难。

对PKMYT1抑制的耐药性与cyclin B1表达降低和CDK1负调控相关：耐药细胞系通过永久性降低cyclin B1表达（而非E2F3沉默或药物外排）防止早熟有丝分裂。RNA测序显示CCNB1转录本减少，蛋白水平一致降低。siRNA敲低CCNB1可降低对lunresertib的敏感性。

WEE1抑制克服E2F3扩增膀胱癌细胞对PKMYT1抑制的耐药性：低剂量zedoresertib与lunresertib联合在药物初治和耐药细胞系中均表现出强协同杀伤效应，可克服PKMYT1抑制剂耐药。

五、讨论与结论

本研究表明，与cyclin E1是复制应激强诱导剂不同，E2F3过表达仅引起轻度和背景依赖性复制应激信号，不足以使细胞对ATR或CHK1抑制敏感。然而，E2F3过表达强烈增加PKMYT1依赖性CDK1-Thr14抑制性磷酸化，挑战了复制应激是lunresertib杀伤效应前提的现有观点。研究结果强烈提示FOXM1靶基因cyclin B1的高水平是缺乏PKMYT1时驱动早熟有丝分裂的先决条件，而cyclin B1下调是PKMYT1抑制剂耐药的主要机制。

PKMYT1对未受干扰细胞的生存非必需，使其成为个性化癌症治疗的有吸引力的候选靶点。TP53突变和E2F3扩增的组合使细胞强烈敏化于PKMYT1抑制，这两种遗传改变在约10-12%的肌层浸润性膀胱癌患者中共发生。PKMYT1抑制与WEE1抑制剂联合特别有前景，可在对非肿瘤细胞低毒性的情况下对膀胱癌细胞产生强协同杀伤。PKMYT1定位于胞质而WEE1定位于核内，双重抑制可导致CDK1池无论亚细胞定位如何均被过度激活，从而增加有丝分裂灾难倾向。此外，PKMYT1抑制与免疫治疗联合值得探索，因为PKMYT1抑制引起的有丝分裂缺陷可能加剧基因组不稳定并增加新表位形成，从而改善免疫检查点抑制剂治疗患者的免疫应答。

结论：E2F3基因扩增使膀胱癌细胞易发生早熟有丝分裂，可被用于设计旨在诱导携带该遗传改变癌症患者发生有丝分裂灾难的精准医学策略。