雷帕霉素治疗性免疫重编程减轻老年动脉粥样硬化小鼠的斑块炎症与淋巴免疫应答

《Aging Cell》：Therapeutic Immune Reprogramming by Rapamycin Attenuates Plaque Inflammation and Lymphoid Immune Responses in Aged Atherosclerotic Mice

　　

衰老是动脉粥样硬化的主要危险因素，并伴随免疫系统的深刻变化，包括效应T细胞扩增、衰老细胞蓄积及促炎信号增强。研究人员探究了雷帕霉素（rapamycin）这一具有前景的年轻化治疗药物——通过抑制mTORC1并调节免疫衰老——在老年动脉粥样硬化小鼠中削弱促动脉粥样硬化免疫应答的潜力。研究人员对80至90周龄、已形成动脉粥样硬化病变的雄性Ldlr^?/?小鼠腹腔注射雷帕霉素或对照溶剂，每周三次，持续8周。通过流式细胞术（flow cytometry）或单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）评估全身及斑块免疫状况，并通过组织学评估斑块形态。雷帕霉素治疗降低了斑块巨噬细胞含量（0.73±0.07×10⁵ μm²），与对照组相比（对照组：0.95±0.09×10⁵ μm²，p<0.05），并减少了血管及淋巴组织中的总T细胞数量。这伴随着从效应记忆表型向中央记忆表型的转变，尤其在CD8⁺亚群中，以及调节性CD4⁺ T细胞（regulatory CD4⁺ T cells, Tregs）的相对富集。主动脉Tregs的单细胞转录组学显示，雷帕霉素处理后抑制性基因（Foxp3、Tgfb1）表达升高。雷帕霉素还减少了滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells, Tfh）、IL-21表达、生发中心B细胞（germinal center B cells）、浆细胞（plasma cells）以及总免疫球蛋白和氧化特异性表位特异性免疫球蛋白水平。此外，脾脏和淋巴结中的年龄相关B细胞（age-associated B cells, ABCs）减少，反映了对B细胞免疫更广泛的抗炎效应。最后，主动脉白细胞的衰老富集评分显著降低。雷帕霉素重塑老年动脉粥样硬化小鼠的免疫图景，促进调节性淋巴细胞亚群，并抑制抗原驱动及炎症性免疫应答。这些发现凸显了免疫靶向年轻化策略在减轻年龄相关动脉粥样硬化炎症方面的潜力。

**论文解读：雷帕霉素通过免疫重编程减轻老年动脉粥样硬化小鼠的斑块炎症与淋巴免疫应答**

**一、研究背景与目的**

全球预期寿命不断延长，年龄相关疾病（如心血管疾病，cardiovascular disease, CVD）的负担随之加重。动脉粥样硬化是CVD最常见的潜在病理基础，以低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）在血管内膜的滞留和氧化为特征。氧化型LDL（oxidized LDL, oxLDL）被巨噬细胞吞噬后形成泡沫细胞，驱动斑块发展。该过程募集先天性和适应性免疫系统的多种免疫细胞，其中调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）、B1细胞和Trem2^hi巨噬细胞具有动脉粥样硬化保护作用，而Th1细胞、炎性巨噬细胞和B2细胞则促进动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化中，免疫平衡被打破，向促炎性免疫偏移，驱动慢性炎症和疾病进展。

衰老通过免疫衰老（immunosenescence）加剧这一失衡。免疫衰老表现为造血干细胞向髓系谱系偏移、初始淋巴细胞丢失、增殖能力受损以及衰老细胞蓄积。衰老细胞呈现衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），以持续细胞因子分泌、细胞周期阻滞和抗凋亡为特征，形成驱动慢性低度炎症（称为炎症老化，inflammaging）的微环境。衰老免疫系统还出现年龄相关促炎性免疫亚群，如表达颗粒酶K的CD8⁺ T细胞和年龄相关B细胞（age-associated B cells, ABCs），这些亚群在人和小鼠动脉粥样硬化斑块中均有发现。这种慢性炎症偏移可能使斑块更易破裂，增加急性心血管事件风险。

雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1）的别构抑制剂，通过与FK506结合蛋白12形成复合物来阻断mTORC1功能。在IL-2刺激的T细胞中，雷帕霉素阻滞G1/S期进程，抑制效应T细胞应答，同时选择性允许Tregs扩增。mTORC1活性与细胞衰老相关，雷帕霉素可下调p53等关键衰老标志物，减轻oxLDL诱导的血管平滑肌细胞衰老，并体内外 rejuvenates 衰老造血干细胞。临床前证据还表明雷帕霉素对其他年龄相关疾病有益。已有研究显示，冠状动脉疾病患者中的雷帕霉素洗脱支架可增加Treg数量，年轻动脉粥样硬化小鼠中mTOR抑制可减轻斑块负担。然而，雷帕霉素如何影响动脉粥样硬化中的年龄相关免疫应答尚不清楚，这对于雷帕霉素-based疗法向老年CVD人群转化至关重要。因此，研究人员旨在探究雷帕霉素诱导的mTOR抑制能否减轻老年动脉粥样硬化Ldlr^?/?小鼠的斑块炎症并恢复免疫稳态。

**二、研究设计与主要技术方法**

研究人员使用80至90周龄雄性Ldlr^?/?小鼠（已建立动脉粥样硬化病变），随机分为雷帕霉素治疗组（n=16）和对照组（n=16），腹腔注射1 mg/kg雷帕霉素或对照溶剂，每周三次，持续8周。主要技术方法包括：流式细胞术（flow cytometry）分析免疫细胞亚群；单细胞RNA测序（scRNA-seq）对主动脉CD45⁺细胞进行转录组分析（对照组n=19，雷帕霉素组n=20）；组织学染色（油红O、Masson三色、MOMA-2免疫组化）评估斑块形态与组成；LEGENDplex检测血清细胞因子和免疫球蛋白水平；ELISA检测氧化特异性表位（OSE）特异性抗体；实时定量PCR检测衰老相关基因表达。人类颈动脉斑块样本来自18例AtheroExpress患者，小鼠主动脉scRNA-seq数据来自既往发表的年轻普通饮食（2月龄，n=9）、年轻西方饮食（4-5月龄，n=29）和老年普通饮食（20月龄，n=12）雌性Ldlr^?/?小鼠。

**三、主要研究结果**

**3.1 mTOR在人和小鼠动脉粥样硬化斑块中表达**

通过分析人类颈动脉斑块scRNA-seq数据（18例患者），研究人员发现MTOR在14个细胞簇中广泛表达，其中B细胞表达相对较高。分析小鼠主动脉scRNA-seq数据集发现，衰老和西方饮食均升高T细胞和巨噬细胞中的Mtor水平，B细胞显示最高平均表达。体外实验表明，10 ng/mL雷帕霉素处理48小时显著降低总B细胞频率，增加CD8⁺ T细胞相对比例，抑制CD4⁺ T细胞增殖，并促使CD4⁺ T细胞向耐受原性表型偏移（T-bet⁺减少，FoxP3⁺增加）。

**3.2 雷帕霉素调节免疫细胞群而不影响斑块形态**

体内实验中，雷帕霉素治疗不影响体重，但显著增加总胆固醇水平（对照组258.4±10.7 vs 雷帕霉素组322.7±16.3 mg/dL, p<0.01）。组织学分析显示斑块大小、体积、胶原含量和坏死核心面积均无显著改变，但斑块巨噬细胞含量显著降低（绝对水平和斑块面积百分比均降低）。流式细胞术显示主动脉CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞显著减少，CD4⁺ T细胞总数降低，Tregs相对频率增加（57.08%±3.77% vs 70.6%±3.00%, p<0.01），CD8⁺ T细胞和CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞数量减少。

**3.3 单细胞RNA测序揭示雷帕霉素的细胞类型特异性免疫调节**

主动脉CD45⁺细胞scRNA-seq分析（共32,859个细胞）鉴定出45个亚簇，归属为6大免疫细胞群。雷帕霉素重塑免疫图景：髓系细胞中Il1b^hi炎性巨噬细胞增加，Nlrp3^hi和Ccr2^hi亚群减少，Trem2^hi巨噬细胞降低；中性粒细胞簇持续减少。B细胞亚群分析显示，生发中心（germinal center, GC）B细胞（表达Mef2b、Aicda、Fas、Mki67）在雷帕霉素处理后几乎消失，浆细胞减少，免疫球蛋白相关基因表达降低。T细胞分析显示，雷帕霉素显著减少效应记忆CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群，增加初始和中央记忆亚群，Tregs保留并显示Foxp3和Tgfb1表达升高，富集IL-10和CTLA-4信号通路。

**3.4 mTOR抑制减弱淋巴结免疫应答同时保留调节性T细胞**

纵隔淋巴结总免疫细胞数减少近6倍（对照组9.9±1.5×10⁴ vs 雷帕霉素组1.7±0.2×10⁴, p<0.0001），髓系、B和T细胞均下降。CD8⁺ T细胞增殖减少，中央记忆亚群相对增加。CD4⁺ T细胞中效应记忆增加、效应样细胞减少，Tregs显著增加（37.18%±1.22% vs 49.67%±2.01%, p<0.0001）。ABCs显著减少，GC B细胞几乎消失（1.16%±0.23% vs 0.04%±0.01%, p<0.0001），血清IgM和IgG（IgG1、IgG2b、IgG2c）水平均显著降低，抗MAA和抗oxLDL抗体也显著减少。

**3.5 雷帕霉素重塑脾脏T和B细胞区室**

脾脏总免疫细胞数不变，但CD4⁺ T细胞减少，髓系细胞增加。CD8⁺ T细胞中央记忆亚群增加，CD4⁺ T细胞增殖降低。Tregs增加（34.78%±0.89% vs 38.66%±1.60%, p<0.05），刺激后IL-10产生增加。滤泡辅助性T细胞（Tfh）频率显著降低（10.84%±0.47% vs 7.07%±0.61%, p<0.0001），Il21基因表达下降。B细胞区室中B2细胞比例增加，滤泡B细胞升高，CD23^?CD21^? B细胞减少，ABCs呈下降趋势，GC B细胞频率略增。

**3.6 衰老相关基因表达改变**

主动脉白细胞中，B细胞、胸腺外双阳性T细胞、NK细胞和常规T细胞的SenMayo富集评分在雷帕霉素处理后显著降低。脾脏中CD27^? CD4⁺ T细胞比例增加，但CD8⁺ T细胞CD27表达和TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞频率不受影响。衰老相关基因Btg2和Cdkn2a（编码p16）表达显著下调，而Cdkn1a（p21）和Trp53（p53）无改变。

**四、讨论与结论**

研究发现雷帕霉素在老年动脉粥样硬化小鼠中发挥多方面免疫调节作用：减少斑块巨噬细胞和中性粒细胞含量，减轻斑块炎症；促进Tregs扩增并增强其抑制功能；抑制Tfh-GC B细胞轴，降低生发中心B细胞、浆细胞和抗原驱动体液免疫应答；减少ABCs；降低主动脉白细胞的衰老相关转录特征。尽管总胆固醇升高，斑块负担保持稳定，提示雷帕霉素的免疫调节作用抵消了胆固醇升高的促动脉粥样硬化效应。研究也存在局限性：主动脉弓未评估斑块大小（因用于scRNA-seq）、生发中心结构未经组织学确认。总体而言，雷帕霉素通过靶向免疫衰老和重塑免疫平衡，有望成为老年动脉粥样硬化的免疫调节策略，但需谨慎考虑其对适应性免疫的广泛抑制以及胆固醇升高问题，联合他汀类降脂治疗可能进一步优化心血管结局。