广藿香水提物（PCAE）通过下调CDC2/Cyclin B1诱导三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）有丝分裂延迟

《Biochemistry Research International》：Pogostemon Cablin Aqueous Extract (PCAE) Induces Mitotic Delay by Downregulating CDC2/Cyclin B1 in TNBC Cells (MDA-MB-231)

　　

广藿香（*Pogostemon cablin*，PC）是一种具有多种药理活性的传统药用植物，既往研究报道其具有抗癌效应。然而，该植物在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中的治疗潜力仍有许多未知之处。在本研究中，研究人员探讨了广藿香水提物（PC aqueous extract，PCAE）在MDA-MB-231 TNBC细胞中的抗增殖活性，并探索了其抗癌效应的相关因素。采用MTT法评估细胞毒性，同时分析了细胞凋亡、细胞周期分布、细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）及有丝分裂进程。通过蛋白质印迹法检测G2/M期调节蛋白的表达。PCAE以剂量依赖性和时间依赖性方式显著抑制TNBC细胞生长，且未诱导显著的细胞凋亡、线粒体膜去极化或caspase-3活化。相反，PCAE显著增加G2/M期细胞积累和有丝分裂指数，并伴随CDC25C磷酸化水平改变以及CDC2和cyclin B1表达下调。这些分子改变表明，PCAE通过抑制CDC25C–CDC2/cyclin B1调节轴干扰有丝分裂进程。综上所述，研究结果表明，PCAE主要通过诱导有丝分裂延迟而非细胞凋亡来抑制TNBC细胞生长，这为PC的抗肿瘤活性提供了新的机制见解，并提示其可能成为TNBC的潜在治疗候选药物。

**论文解读：广藿香水提物通过下调CDC2/Cyclin B1诱导三阴性乳腺癌细胞有丝分裂延迟**

**一、研究背景与科学问题**

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）约占乳腺癌患者的15%–20%，其肿瘤细胞缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）三种临床公认的治疗靶点。这一受体表型特征伴随高度侵袭性的疾病行为，表现为肿瘤生长迅速、早期发生远处转移、复发频繁以及患者生存率相对较低。尽管全身性治疗取得了显著进展，但由于缺乏有效的分子靶点，TNBC的治疗选择仍主要依赖化疗。此外，肿瘤固有的异质性、治疗耐药以及治疗相关毒性持续制约临床结局。

传统抗癌方案面临的治疗挑战，尤其是治疗相关毒性和不完全的临床缓解，推动了替代治疗策略的探索。补充与替代医学（complementary and alternative medicine，CAM），特别是药用植物及其来源的生物活性化合物的应用，日益受到科学界的关注。天然产物可通过同时调节多条分子和细胞通路发挥抗癌作用，且部分产物相较传统细胞毒药物具有更好的耐受性。广藿香（*Pogostemon cablin*，PC）作为亚洲传统医学中广泛使用的药用植物，具有抗氧化、抗突变和免疫调节等多种生物学活性。近年来，PC在结肠癌、急性髓系白血病和肝癌中被研究作为补充抗肿瘤药物，展现出广泛的肿瘤治疗潜力。研究人员前期研究已证明广藿香水提物（PCAE）通过诱导线粒体介导的细胞凋亡抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞生长，但PCAE在TNBC中是否发挥类似作用尚不清楚。因此，本研究以MDA-MB-231 TNBC细胞为模型，系统探讨PCAE的抗增殖活性及其分子机制。

**二、研究方法概述**

研究人员采用MTT法检测PCAE对MDA-MB-231细胞活力的影响并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和caspase-3活性检测评估细胞凋亡；利用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（ΔΨm）；以DCFH-DA探针测定细胞内活性氧（ROS）水平；通过PI染色流式细胞术分析细胞周期分布；采用MPM-2抗体标记结合流式细胞术和共聚焦显微镜评估有丝分裂进程和有丝分裂指数；运用蛋白质印迹法检测CDC25C磷酸化水平及CDC2、cyclin B1蛋白表达。MDA-MB-231细胞系购自美国ATCC（RRID: CVCL_0062），培养于含10%胎牛血清的Leibovitz's L-15培养基中。

**三、主要研究结果**

**3.1 PCAE抑制TNBC细胞活力与增殖能力**

MTT实验显示，随着PCAE浓度（0–5 mg/mL）和处理时间（24–72 h）的增加，MDA-MB-231细胞活力呈进行性下降，呈现明确的浓度和时间依赖性。线性回归分析显示PCAE浓度与细胞存活率呈强负相关（y = ?26.346x + 132.25，R2 = 0.9548）。24、48和72 h的IC₅₀值分别为3.827、3.044和1.951 mg/mL。

**3.2 PCAE的生长抑制作用与凋亡和坏死无关**

Annexin V-FITC/PI染色结果表明，PCAE处理并未显著增加早期或晚期凋亡细胞及坏死细胞的比例。caspase-3活性在PCAE暴露24 h后亦无明显变化。这些结果提示PCAE介导的生长抑制通过非凋亡机制实现。

**3.3 PCAE对线粒体膜电位（ΔΨm）影响甚微**

JC-1染色检测显示，PCAE处理6 h后仅引起轻微的荧光偏移，但未达到统计学显著性。定量分析确认PCAE处理组与未处理组之间的ΔΨm无显著差异，表明PCAE的生长抑制活性不伴随明显的线粒体膜电位丧失。

**3.4 PCAE降低MDA-MB-231细胞内ROS积累**

DCFH-DA染色结合流式细胞术分析显示，PCAE处理后细胞内ROS水平呈浓度相关性降低，其中5 mg/mL PCAE组显著低于未处理组。使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为ROS清除剂和绿脓菌素（PYO）作为ROS诱导剂验证了检测系统的响应性。这表明ROS过量产生并非PCAE介导生长抑制的主要机制。

**3.5 PCAE促进MDA-MB-231细胞G2/M期积累**

细胞周期分析显示，PCAE处理24 h后，G2/M期细胞比例随PCAE浓度升高而进行性增加，同时G0/G1期细胞比例相应减少。定量分析证实PCAE浓度与G2/M期细胞百分比呈正线性关系（R2 = 0.8346），与G0/G1期细胞比例呈负相关（R2 = 0.9245）。

**3.6 PCAE促进MDA-MB-231细胞有丝分裂积累**

利用有丝分裂特异性标志物MPM-2进行检测，PCAE处理以剂量依赖性方式显著提高MPM-2阳性细胞比例，从未处理组的27%升至最高浓度组的97%。值得注意的是，2.5 mg/mL PCAE诱导的MPM-2表达水平与微管干扰剂诺考达唑（nocodazole）阳性对照组相当，表明PCAE能有效干扰有丝分裂进程。

**3.7 PCAE通过下调CDC2和Cyclin B1诱导G2/M期阻滞**

蛋白质印迹分析显示，PCAE显著降低cyclin B1和CDC2的表达水平，且呈浓度依赖性。这两种蛋白是细胞进入有丝分裂的关键调控因子，其下调与G2/M期积累一致，表明PCAE通过干扰CDC2/cyclin B1复合物的激活介导有丝分裂延迟。

**3.8 PCAE改变MDA-MB-231细胞CDC25C磷酸化状态**

Western blot检测发现，PCAE处理后CDC25C磷酸化水平呈浓度依赖性升高，p-CDC25C/CDC25C比率显著增加（y = 3.6965x + 97.28，R2 = 0.765）。结合CDC2和cyclin B1表达的下调，这些结果提示PCAE通过调控CDC25C–CDC2/cyclin B1信号轴干扰G2/M检查点调控，进而损害有丝分裂进程。

**四、结论与讨论**

本研究首次证明PCAE通过抑制cyclin B1/CDC2调节轴诱导有丝分裂延迟，从而有效抑制TNBC细胞生长。与研究人员在子宫内膜癌细胞中观察到的凋亡诱导机制不同，PCAE在MDA-MB-231细胞中并不主要诱导凋亡，而是通过细胞周期阻滞发挥抗增殖作用。研究结果表明，PCAE诱导的有丝分裂延迟并非主要通过CDC25C磷酸化介导，而是通过cyclin B1和CDC2的下调实现，这些关键G2/M调节蛋白的抑制可能导致癌细胞不可逆的生长停滞。

本研究存在一定局限性：所有实验均在体外使用MDA-MB-231细胞系进行，可能无法完全反映体内复杂肿瘤微环境中PCAE的活性；PCAE中发挥抗癌作用的精确生物活性化合物尚未鉴定，其植物化学组分间可能的协同或拮抗作用有待阐明；虽然cyclin B1和CDC2下调是PCAE诱导有丝分裂延迟的基础，但其他分子通路也可能参与其中。未来研究应在动物模型中验证这些发现，评估PCAE的体内药效、药代动力学和安全性，并通过生物活性指导的分离和代谢组学分析鉴定活性成分及其分子靶点。

综上所述，本研究证明PCAE通过抑制cyclin B1/CDC2调控通路诱导有丝分裂延迟，对TNBC细胞表现出有效的抗癌活性。鉴于TNBC的侵袭性本质和有限的治疗选择，PCAE有望开发为化学预防或辅助抗癌候选药物，为乳腺癌管理提供补充或预防策略。