超声辅助低共熔溶剂提取牛蒡多糖及其表征与生物活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Ultrasonic-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction, Characterization, and Bioactivities of Arctium lappa L. Polysaccharides

　　

尽管牛蒡（Arctium lappa L.）多糖（ALPs）具有公认的药理学潜力，但利用低共熔溶剂（DES）结合超声对其进行绿色提取此前尚未被探索。本研究首次报道了一种基于DES的超声辅助提取（DES-UAE）优化方案用于ALPs。响应面优化确定了以下条件：氯化胆碱/草酸摩尔比为2:1，含水量为18.508%，液固比为37.425 mL/g，提取时间为97.262 min，超声功率为275.787 W，多糖得率为16.581%。经序列色谱纯化获得均一组分ALPs-1，其重均分子量为8827 Da。单糖分析表明，ALPs-1由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为2.18:1.00:6.62:7.17。在功能方面，ALPs-1表现出中等的α-葡萄糖苷酶抑制活性、较弱的DPPH•清除活性以及显著的ABTS•+清除活性（IC50 = 0.87 mg/mL）。重要的是，ALPs-1显著抑制了脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞中NO、TNF-α和IL-1β的产生，并保护斑马鱼角质形成细胞免受甲硝唑诱导的氧化损伤。这些结果表明，ALPs-1具有 promising 的抗氧化、降血糖和抗神经炎症活性。本研究为DES-UAE在提取生物活性ALPs中的有效应用提供了首个证据，支持其在功能性食品和药物中的潜在应用。

论文解读：超声辅助低共熔溶剂提取牛蒡多糖的工艺优化、结构表征与生物活性评价

一、研究背景与科学问题

牛蒡（Arctium lappa L.）作为一种传统药食两用植物，在中国广泛栽培，具有疏风清热、消肿解毒等功效。牛蒡根富含菊粉型多糖，已被证实具有降血糖作用，对糖尿病患者具有潜在治疗价值。然而，传统多糖提取方法——如热水浸提结合乙醇沉淀——存在提取效率低、能耗大、依赖挥发性有机溶剂等固有缺陷，带来环境和安全隐患。近年来，低共熔溶剂（DES）作为一类新型绿色溶剂受到广泛关注，其具有理化性质可调、毒性低、可生物降解及对天然产物溶解能力强等优势。超声辅助提取（UAE）利用声空化效应增强传质、提高提取效率，已广泛与溶剂提取平台结合。尽管DES-UAE整合模式已在多种天然产物提取中展现出多功能性，但其在牛蒡多糖（ALPs）提取中的应用此前未见报道。此外，ALPs的抗神经炎症作用缺乏系统研究，其α-葡萄糖苷酶抑制活性亦需深入探究。基于上述研究空白，本研究旨在：第一，建立并优化针对ALPs的超声辅助DES提取新方法；第二，分离、纯化并全面表征主要多糖组分ALPs-1的分子量、组成特征和均一性；第三，系统评价其抗氧化、降血糖和抗神经炎症等多终点生物活性。

二、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：以氯化胆碱为氢键受体、草酸为氢键供体构建七种DES配方进行筛选；采用单因素实验考察摩尔比、含水量、超声功率、液固比和提取时间对得率的影响；运用Box-Behnken设计（BBD）结合响应面法（RSM）进行四因素三水平优化；通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱对粗多糖进行逐级纯化；采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量和均一性；采用高效液相色谱（HPLC）结合PMP柱前衍生化分析单糖组成；通过α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制实验、DPPH•和ABTS•⁺自由基清除实验评价体外活性；利用转基因斑马鱼Tg(krt4:NTR:GFP)^cy17品系建立甲硝唑诱导的氧化应激模型评价体内抗氧化活性；以LPS刺激的BV2小鼠小胶质细胞模型评价抗神经炎症活性。

三、研究结果

3.1 DES筛选结果：在七种DES配方中，DES-1（氯化胆碱/草酸，1:1）获得最高得率15.64%。草酸作为二元羧酸具有强氢键供体能力和较强酸性（pKa₁ = 1.25），有利于破坏植物细胞壁氢键网络并促进多糖溶解；30%水稀释后黏度较低（约50 mPa·s，40°C），利于超声下传质；游离羧基还可能介导温和酸催化裂解细胞壁多糖。

3.2 单因素实验结果：摩尔比2:1时得率最高，对应DES共晶点，具有最低熔点、最佳流动性和黏度；含水量10%时得率最高，过多水分会削弱DES与多糖间的氢键作用；超声功率240 W时得率最高，过高功率可能损伤多糖链完整性；液固比40 mL/g时得率最高，过多溶剂会促进杂质共溶；提取时间100 min时得率最高，过长时间可能导致多糖结构降解。

3.3 响应面优化结果：BBD设计29次运行，拟合二次多项式模型，R² = 0.8712，模型显著（p < 0.05），失拟项不显著。因素重要性排序为：含水量 > 超声功率 > 提取时间 > 液固比。所有两两交互项均不显著，表明各因素独立作用。理论最优条件为含水量18.516%、超声功率275.867 W、提取时间97.278 min、液固比1:37.46 g/mL，预测得率16.581%。经圆整后验证实验（含水量20%、功率280 W、时间97 min、液固比1:40 g/mL）实测得率16.281%，与预测值高度吻合。

3.4 方法比较结果：DES-UAE得率（16.581%）显著高于室温水浸提（7.81%）和超声水提（9.39%），证实DES方法的优越性。

3.5 纯化与表征结果：粗多糖经DEAE-Sepharose阴离子交换色谱，主峰在约0.3 M NaCl处洗脱（酸性多糖特征），经Sephadex G-75凝胶过滤获得单一对称峰，即纯化组分ALPs-1。总碳水化合物含量94.6% ± 1.2%，残余蛋白1.2% ± 0.3%，糖醛酸含量5.1% ± 0.4%，三者合计100.9%。HPGPC显示单一对称峰，重均分子量（M_w）为8827 Da，数均分子量（M_n）为7850 Da，多分散指数（PDI）为1.12，表明高度均一。

3.6 单糖组成分析结果：ALPs-1由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为2.18:1.00:6.62:7.17，半乳糖为主要糖残基。葡萄糖醛酸的存在表明ALPs-1为酸性多糖，与DEAE柱0.3 M NaCl洗脱行为一致。与文献报道的菊粉型果聚糖（以果糖和葡萄糖为主）及含半乳糖醛酸的果胶型多糖不同，ALPs-1以葡萄糖醛酸而非半乳糖醛酸为糖醛酸组分，这一特征较为罕见。

3.7 生物活性结果：α-葡萄糖苷酶抑制实验显示ALPs-1呈剂量依赖性抑制，IC₅₀ = 2.805 mg/mL，约为阿卡波糖（IC₅₀ = 0.099 mg/mL）的1/28；α-淀粉酶抑制IC₅₀ = 6.637 mg/mL，约为阿卡波糖（0.127 mg/mL）的1/52。DPPH•清除IC₅₀ = 84.192 mg/mL，活性极弱；ABTS•⁺清除IC₅₀ = 0.87 mg/mL，活性中等，两者约97倍差异可能归因于ABTS•⁺的水相兼容性。

3.8 斑马鱼体内抗氧化结果：甲硝唑（400 μg/mL）显著降低角质形成细胞GFP荧光（p < 0.001）。ALPs-1在1、10、100 μg/mL剂量下均显著保护角质形成细胞免受氧化损伤（p < 0.001），相对抗氧化能力分别为92.2%、89.9%和85.5%，呈现非单调剂量-反应关系，最低剂量保护效果最佳。维生素C阳性对照（35 μg/mL）相对抗氧化能力为48.0%。

3.9 抗神经炎症结果：CCK-8实验表明ALPs-1在3–12 μg/mL范围内对LPS激活的BV2细胞无细胞毒性。ALPs-1显著抑制LPS诱导的NO产生（p < 0.01或p < 0.001），在6和12 μg/mL剂量下显著抑制TNF-α和IL-1β分泌（p < 0.05至p < 0.001）。12 μg/mL剂量下TNF-α降低约35%，IL-1β降低约42%，但均未恢复至未刺激对照水平，表明部分而非完全阻断炎症级联反应。

四、讨论与结论

ALPs-1（M_w = 8.8 kDa）在分子量上接近菊粉型果聚糖，但单糖组成（含糖醛酸和鼠李糖、不含果糖）具有酸性多糖特征。其葡萄糖醛酸含量较低（约5.9%），足以赋予负电荷并解释DEAE柱结合行为。与文献报道的牛蒡酸性多糖相比，ALPs-1的抗氧化活性较弱（DPPH IC₅₀ = 84.2 mg/mL vs. ALP-1的0.52 mg/mL），可能归因于较低的糖醛酸含量和缺乏阿拉伯糖。α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC₅₀ = 2.81 mg/mL）处于文献报道范围（0.5–5.0 mg/mL）的高端。与菊苣果胶和向日葵多糖相比，ALPs-1抗氧化活性较弱，与其较低分子量和糖醛酸含量一致。

本研究首次证明DES-UAE可从牛蒡中提取含葡萄糖醛酸的生物活性多糖。ALPs-1具有中等至较弱的抗氧化和降血糖活性，但表现出显著的体内抗氧化保护作用和体外抗神经炎症活性。研究提出的氢键作用等机制假说尚需分子对接、表面等离子共振等直接证据验证。ALPs-1的独特单糖组成（葡萄糖醛酸而非半乳糖醛酸）值得进一步结构研究。该工作为DES-UAE在生物活性多糖提取中的应用提供了首个证据，支持ALPs-1作为功能性食品和药物中生物活性成分的潜在应用前景。