《Chemistry & Biodiversity》：Veratric Acid and the Cytotoxic Activity of Handroanthus impetiginosus Inner Bark Extract: No Association
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粉花风铃木（Handroanthus impetiginosus）是一种药用树木，也是生物活性化合物的来源，其细胞毒性常被归因于拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌。由于这些化合物可能以较低浓度存在，本研究评估了藜芦酸（veratric acid）作为该内皮提取物细
粉花风铃木（Handroanthus impetiginosus）是一种药用树木，也是生物活性化合物的来源，其细胞毒性常被归因于拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌。由于这些化合物可能以较低浓度存在，本研究评估了藜芦酸（veratric acid）作为该内皮提取物细胞毒活性替代植物化学标记物的可行性。通过动态浸渍法制备水-乙醇提取物，经冷冻干燥后，对其总多酚含量、抗氧化活性及植物化学特征进行了表征。研究人员在HUVEC、MDA-MB-231、A549和HepG2细胞中评估了提取物和藜芦酸的细胞毒性效应。在所测试条件下，提取物对肿瘤细胞活力的抑制作用强于对HUVEC活力的抑制作用。相比之下，相当于提取物中浓度的藜芦酸并未降低细胞活力。这些研究结果表明，藜芦酸并不能解释该提取物的细胞毒性，因此在所评价条件下不适合作为该生物学效应的标记物。
论文解读
**研究背景与目的**
癌症仍是全球重大公共卫生挑战，2020年全球约有1930万新发癌症病例和近1000万癌症相关死亡。天然产物一直是抗癌药物研发的重要来源，多种现代抗癌药物如长春碱和紫杉醇均源自药用植物。粉花风铃木（Handroanthus impetiginosus (Mart. ex DC.) Mattos，Bignoniaceae）是一种原产于中南美洲热带雨林的药用树木，其传统应用可追溯至印加文明，长期被原住民用于治疗炎症、感染和癌症。植物化学研究表明，其内皮和心材含有丰富的生物活性化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等活性。这些生物学活性被归因于多种植物化学物质，尤其是醌类、黄酮类和酚酸类。尽管该物种已鉴定出163种化合物，但其抗肿瘤活性主要被归因于拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌等萘醌类化合物，这些化合物因此成为该物种中研究最深入的物质。然而，这些化合物在植物中浓度相对较低，给提取、鉴定和定量带来困难，限制了进一步研究。基于此，Jin等人提出将藜芦酸作为粉花风铃木的替代植物化学标记物。藜芦酸具有抗菌、抗真菌、抗氧化、抗炎、抗高血压和光保护等活性，但支持其与抗肿瘤活性相关联的证据仍然有限。本研究旨在评价藜芦酸作为粉花风铃木细胞毒活性植物化学标记物的可行性，对内皮进行理化表征，制备水-乙醇提取物并评价其抗氧化活性、总多酚含量和植物化学特征，重点关注藜芦酸及拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌，同时在肿瘤和非肿瘤细胞系中评估提取物和藜芦酸标准品的体外细胞毒活性。
**主要技术方法**
研究人员从巴西亚马逊地区帕林廷斯市商业采购干燥粉花风铃木内皮，将其在40°C强制通风干燥箱中干燥至恒重，经刀式磨粉机粉碎后，依次采用卡尔·费休滴定法测定残余水分含量、105°C失重法测定干燥失重、水分活度仪测定水活度、机械筛分测定粒径分布（D10、D50、D90及SPAN指数）、扫描电子显微镜（SEM）观察颗粒形态、傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析官能团、热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）评估热行为。提取采用70%（v/v）水-乙醇溶液在70°C下动态浸渍120分钟，料液比1:20（w/v），真空过滤后旋转蒸发浓缩，加入5%（w/w，干基）胶体二氧化硅作为干燥助剂，经冷冻干燥获得冻干提取物。对提取液测定固形物含量和提取效率；对冻干提取物采用Folin-Denis法测定总多酚含量（以焦性没食子酸当量表示），DPPH自由基清除法测定抗氧化活性（IC50-DPPH），FTIR和SEM表征理化性质，高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析植物化学特征并检测藜芦酸、拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌。细胞活力采用刃天青（resazurin）还原法评估，选用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肝细胞癌细胞（HepG2）、人三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人肺癌细胞（A549），提取物浓度范围为500.0至62.5 μg/mL（E1–E4），藜芦酸浓度范围为8.15至1.02 μg/mL（VA1–VA4），同时设置溶剂对照（SC，1.75% v/v乙醇）、阴性对照（NC，新鲜培养基）和阳性对照（PC，4% v/v DMSO）。数据经单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行统计处理，IC50值通过线性插值估算。
**研究结果**
**2.1 植物材料表征**
干燥粉碎的内皮含水量低，水分含量为7.47 ± 0.24%（w/w），干燥失重为7.87 ± 0.11%（w/w），均低于14%的推荐阈值；水活度值为0.4617 ± 0.0100，低于0.5的公认上限，表明游离水有限，水分依赖性变质和微生物生长的理论可能性较低。TGA和DSC分析与低残余水分含量一致，100°C附近仅约10%质量损失。粒径分析显示D10、D50和D90分别为99.93 ± 0.35 μm、201.69 ± 2.39 μm和321.90 ± 1.42 μm，SPAN指数为1.10 ± 0.01，表明粒径分布较窄。SEM图像显示不规则非球形颗粒，表面粗糙异质，这些形态特征有利于增加暴露面积和溶剂渗透，提高提取效率。FTIR分析鉴定出三个主要特征谱带：谱带I（3600–3200 cm?1）归因于羟基化合物νO–H伸缩振动，谱带II（约2920–2850 cm?1）归因于脂肪族νC–H伸缩振动，谱带III（1800–1000 cm?1）对应指纹区含氧成分的重叠振动。最大可提取物质量（Ce）在70%（v/v）水-乙醇溶液中为0.52 ± 0.01%（w/w），表明可溶性成分比例较低，与木质材料的纤维素和木质素等不溶性结构成分占主导相符。
**2.2 液体和冻干提取物表征**
提取液固形物含量为0.37 ± 0.03%（w/w），提取效率η为71.2%，表明溶剂可提取组分的回收有效。冻干提取物呈自由流动粉末，SEM显示以不规则非球形颗粒为主，多数尺寸低于约100 μm，无大型致密团聚体。FTIR分析显示提取物与植物材料整体轮廓相似，但谱带I和III区域的强度更高，与提取后可溶性含氧成分（尤其是酚酸、醇类、糖类等极性成分）的富集一致。总多酚含量为32.95 ± 4.46 μgPE/mg（以焦性没食子酸当量计），IC50-DPPH为33.90 μg/mL，表明具有可测量的DPPH自由基清除活性，与多酚含量和抗氧化能力之间的既有关系相符。HPLC-DAD分析在所用分析条件下未检测到拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌，与该物种中这些化合物低丰度的已有报道一致；相比之下，藜芦酸被检出，含量估计为1.63%（w/w），表明其作为该提取物易检测分析成分的可行性。观察到的植物化学特征可部分归因于提取条件：70%（v/v）水-乙醇为极性质子溶剂体系，有利于酚类成分的提取，而不利于萘醌类成分的提取（后者通常更适于丙酮、乙腈等非质子有机溶剂）。然而，未检测到不应被解释为植物材料中不存在这些化合物，可能其浓度低于方法检测限。此外，非生物和生物因素也可能导致药用植物植物化学组成的变化。
**2.3 细胞活力评估**
采用刃天青还原法评估冻干提取物和藜芦酸标准品在HUVEC、MDA-MB-231、A549和HepG2四种细胞系中的细胞毒性效应。提取物对三种肿瘤细胞系表现出浓度依赖性细胞毒效应。与阴性对照相比，A549细胞在500、250和125 μg/mL浓度下、HepG2细胞在500、250和125 μg/mL浓度下、MDA-MB-231细胞在500和250 μg/mL浓度下均观察到统计学显著的活力降低（调整后p < 0.0001）。A549和HepG2是最敏感的细胞系，IC50值分别为179.44 ± 8.68 μg/mL和185.10 ± 3.77 μg/mL，而MDA-MB-231对提取物的敏感性较低。溶剂对照在所有细胞系中与阴性对照相比均未显著影响细胞活力，表明观察到的效应归因于提取物成分而非溶解用乙醇。在非肿瘤HUVEC细胞系中，即使最高测试浓度（500 μg/mL）下细胞活力仍保持在50%以上，提示在所评价条件下具有一定程度的选择性。然而，所有测试浓度的藜芦酸均未显著降低细胞活力。提取物最高浓度（E1）与相应藜芦酸等效浓度（VA1）的直接比较在肿瘤细胞系中显示显著差异，进一步证实藜芦酸单独不能解释粉花风铃木提取物观察到的细胞毒活性。文献中分离藜芦酸的细胞毒效应仅在更高浓度下报道（HepG2的IC50为41.2 μg/mL，A549为13.6 μg/mL），Wang等人亦未在高达20.0 μM（约3.64 μg/mL）浓度下观察到藜芦酸的细胞毒性。
**结论**
从粉花风铃木内皮获得的水-乙醇提取物在体外降低了所评价三种肿瘤细胞系的活力，而对HUVEC细胞在测试条件下影响较小。化学表征显示提取物中藜芦酸可被检测到，而拉帕醌、α-拉帕醌和β-拉帕醌在所采用分析条件下未被检测到。藜芦酸在相当于提取物中浓度下并未降低细胞活力，因此在所评价条件下不能解释提取物的细胞毒活性。其他成分可能单独或协同作用导致观察到的活性，需要通过生物测定引导的分离和更广泛的植物化学分析来鉴定与这些效应相关的化合物。
