《Communications Biology》：A human cell-free translation screen identifies the NT-2 mycotoxin as a ribosomal inhibitor that binds the peptidyl transferase center
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翻译抑制剂对于探究核糖体功能及治疗应用具有重要价值，但在人类系统中的系统性发现受限于缺乏可规模化、适用于筛选的无细胞平台。研究人员建立了一种利用人源裂解物的稳健高通量筛选方法，该方法可绕过细胞毒性效应。在筛选约28,000个小分子化合物后，研究人员鉴定出已知及
翻译抑制剂对于探究核糖体功能及治疗应用具有重要价值，但在人类系统中的系统性发现受限于缺乏可规模化、适用于筛选的无细胞平台。研究人员建立了一种利用人源裂解物的稳健高通量筛选方法，该方法可绕过细胞毒性效应。在筛选约28,000个小分子化合物后，研究人员鉴定出已知及新型翻译抑制剂，其中包括NT-2——一种由致病性Fusarium sporotrichioides产生的单端孢霉烯族霉菌毒素。NT-2可抑制人源细胞和酵母裂解物中的蛋白质合成，但对细菌及完整酵母细胞中的翻译无抑制作用。1.76 ?分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构显示NT-2结合于人源60S核糖体的肽基转移酶中心（PTC）。此外，对NT-2处理细胞的cryo-EM分类分析显示核糖体处于非活性eEF2/SERBP1结合的休眠状态。综上，这些结果揭示NT-2是一种此前未被识别的哺乳动物蛋白质合成环境抑制剂，并展示了无细胞翻译筛选在揭示具有意外核糖体命运的新型抑制剂方面的能力。
论文解读：人源无细胞翻译筛选揭示NT-2霉菌毒素作为靶向肽基转移酶中心的核糖体抑制剂
一、研究背景与科学问题
蛋白质合成及其翻译调控在疾病发生与治疗中扮演核心角色，但新型翻译抑制剂的发现长期面临挑战。基于活细胞的筛选虽已鉴定出多种翻译调节化合物，但此类方法固有地受限于化合物摄取、细胞毒性及生理复杂性等因素，这些因素可能掩盖靶点特异性效应。假阳性与漏检候选物的问题持续存在，凸显了对具有高机制分辨率的互补平台的需求。此外，传统无细胞系统如兔网织红细胞裂解物或大肠杆菌裂解物缺乏人源特异性背景，存在组织特异性伪影且难以规模化制备，通常与高通量筛选格式不兼容。
这一空白在天然毒素领域尤为突出。霉菌毒素是普遍存在的真菌代谢产物，污染全球粮食生产并展现强效生物活性，常靶向核心细胞过程。单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）是由镰刀菌属（Fusarium）物种产生的毒性真菌代谢物，因气候变化和农业实践改变而日益污染谷物。全球约四分之一的作物超过霉菌毒素污染监管阈值，60–80%含有可检测水平。尽管多种单端孢霉烯毒素已被证实可抑制真核翻译，但除经典单端孢霉烯外，很少有真菌代谢物在人源系统中被系统研究。NT-2（15-脱乙酰新茄镰孢菌醇）是一种A型单端孢霉烯族霉菌毒素，首次从Fusarium sporotrichioides中分离，其独特的取代模式（包括多个羟基）在化学上区别于已充分研究的T-2和HT-2毒素，但其翻译抑制活性此前未被表征。
二、研究内容与主要结论
研究人员建立了首个基于人源裂解物的高通量无细胞翻译筛选（CFTS）平台，完全兼容384孔板格式。通过筛选约28,000个化合物，鉴定出NT-2——一种来自镰刀菌属的此前未表征的单端孢霉烯族霉菌毒素——作为真核翻译的有效抑制剂。1.76 ?分辨率的cryo-EM结构将NT-2定位于肽基转移酶中心（PTC），并揭示NT-2处理细胞中核糖体积累于非活性eEF2/SERBP1结合的休眠状态。这些发现揭示了一种被忽视的环境威胁，并展示了CFTS在发现新抑制剂和意外核糖体命运方面的能力。
三、关键技术方法
研究人员主要运用以下关键技术方法：基于双重离心法制备的HeLa S3人源翻译活性裂解物建立384孔高通量无细胞翻译筛选平台，以Renilla荧光素酶mRNA为报告基因，通过发光信号定量翻译活性；采用嘌呤霉素掺入实验评估活细胞中蛋白质合成抑制；利用蔗糖密度梯度多聚核糖体图谱分析核糖体状态分布；运用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析NT-2结合的人源80S核糖体高分辨率结构，并通过颗粒分类分析核糖体构象状态；使用Western blot验证翻译产物水平及eIF2α磷酸化状态。细胞实验使用HEK293T细胞和BHK-21仓鼠细胞，细菌系统使用E. coli，真菌系统使用S. cerevisiae。
四、研究结果
人源无细胞翻译筛选平台的开发：研究人员建立了基于人源双重离心裂解物的高通量无细胞翻译筛选平台。优化参数包括低反应体积（每孔5 μL）、冻融兼容性及发光信号稳定性。以放线菌酮（CHX）为基准评估，Z′因子达0.82，动态范围超过三个数量级，板间变异系数低于5%，确立了CFTS作为稳健且人源特异性的可规模化翻译抑制剂发现平台。
化学多样性文库中活性化合物的鉴定：研究人员对来自六个机制和化学多样性文库的27,763个小分子进行高通量CFTS评估，化合物终浓度为10 μM。Prestwick文库（1280个FDA/EMA/PMDA批准药物）和激酶抑制剂文库（275个化合物）共产生17个活性化合物；Repurposing文库（4477个化合物）鉴定出25个活性物，其中嘌呤霉素作为内部阳性对照位居前列；蛋白-蛋白相互作用（PPI）文库（2156个化合物）显示最高表观命中率，277个活性物中7个得分超过0.9；天然产物启发文库（13,431个化合物）产生38个活性物；化学多样性集合扩展（3518个化合物）产生16个命中；天然产物文库（2626个植物和微生物提取物）产生46个初级命中。对232个高分候选物进行剂量-反应验证后，46个分子被分类为次级命中，其中36个此前未与翻译抑制关联。通过Western blot排除12个荧光素酶特异性假阳性，最终5个分子被验证为真正的翻译抑制剂。
霉菌毒素NT-2作为翻译抑制剂的验证：NT-2在初级筛选中命中得分为0.73。剂量-反应分析显示sigmoidal抑制曲线，30 μM以上浓度近乎完全抑制蛋白质合成。使用FLAG标记的RLuc报告mRNA验证，IC50为4.1 μM，Western blot确认NT-2介导的翻译抑制，验证NT-2为人源蛋白质合成的真正抑制剂。
NT-2的真核特异性翻译抑制：嘌呤霉素掺入实验显示NT-2在HEK293T细胞中有效抑制翻译，62.5 nM即检测到抑制，2 μM完全抑制，IC50为135 nM，表明细胞内效力显著高于裂解物。多聚核糖体图谱显示NT-2处理导致80S单体的显著积累和多聚核糖体的明显耗竭。NT-2处理未增加磷酸化eIF2α水平，表明抑制不通过整合应激反应通路介导。在E. coli中，NT-2不影响生长且不抑制S30提取物中的蛋白质合成；在S. cerevisiae中，NT-2不影响细胞生长和活细胞蛋白质合成，但在酵母裂解物中呈浓度依赖性抑制（5 μM时约70%抑制，50 μM时完全抑制），表明种属依赖性差异可能反映摄取、外排或代谢修饰的差异。
NT-2结合60S PTC：研究人员通过单颗粒cryo-EM解析了NT-2处理HEK293T细胞中人源80S核糖体的结构，分辨率达1.76 ?。NT-2密度清晰定位于大亚基PTC的A位裂隙，无细胞内修饰证据。结合由氢键和范德华接触介导，关键相互作用包括NT-2的环氧乙烷基团与U4450的C2核糖羟基、C-3羟基与U4446尿嘧啶碱基O-2、NT-2的氧杂环与C4398胞嘧啶碱基和U4446尿嘧啶碱基之间的氢键，以及4β-乙酰氧基与G3907鸟嘌呤碱基和A4449核糖的氢键。细菌系统中无活性可由原核PTC的差异解释。
NT-2结合PTC的分子架构：P位tRNA和新生多肽链的对接模型显示NT-2占据PTC的A位裂隙，与P位tRNA无直接空间冲突。与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素和疣孢菌素A的结构叠加显示这些化合物占据A位裂隙的相同区域，但取代基差异改变各毒素的空间排布。多聚核糖体图谱显示NT-2处理导致多聚核糖体崩溃和80S积累，表型与harringtonine高度相似，区别于稳定延伸核糖体的CHX。结构比较显示NT-2与harringtonine占据PTC A位区域的相同功能口袋，并与其他多种PTC靶向抑制剂共享结合区域，但NT-2相对于周围rRNA核苷酸采用独特取向。
NT-2结合核糖体与休眠核糖体状态相关：对cryo-EM颗粒的分类分析显示，NT-2处理样本中eEF2结合的80S核糖体占颗粒的39%，而DMSO和NT-2对照样本中分别仅占9%和8%。NT-2处理样本中的eEF2结合80S核糖体一致地显示SERBP1密度和E位tRNA，形成休眠核糖体状态，较对照富集约4倍。eEF2与SERBP1的共存表明NT-2结合核糖体采用被SERBP1识别的非活性构象，区别于典型延伸中间体，对应SERBP1稳定的eEF2结合核糖体休眠状态。
五、讨论与结论
本研究建立了可规模化、人源特异性的无细胞翻译筛选平台，克服了细胞基筛选的固有局限。筛选恢复了包括放线菌酮、嘌呤霉素和T-2毒素在内的已知抑制剂，以及化学多样化的新型命中物。NT-2的跨物种谱突出了生理学和核糖体进化如何决定抑制剂敏感性：在哺乳动物细胞中抑制强于裂解物，表明增强摄取或内源通路增效；对E. coli无影响证实严格真核特异性；在酵母中裂解物有活性但活细胞无效应，可能因酵母细胞壁限制细胞内进入。1.76 ? cryo-EM结构将NT-2明确置于PTC A位裂隙，与多聚核糖体崩溃和80S积累一致，支持其干扰早期翻译后起始或早期延伸循环步骤。R2–eEF2颗粒仅在NT-2处理细胞的核糖体中积累而非体外处理核糖体，凸显在生理背景下研究抑制剂的重要性。SERBP1的存在表明这些复合物与休眠状态相关，扩展了SERBP1作为核糖体保存因子的已知作用。研究结论：NT-2是一种有效的、真核特异性的核糖体抑制剂，结合PTC并与含SERBP1的休眠核糖体相关；可规模化的人源无细胞翻译筛选平台为发现翻译调节化合物和将环境毒素与核糖体生物学联系起来提供了高分辨率策略。
