《Drug Development Research》：Comprehensive Evaluation of Gastrointestinal Factors Influencing the Stability and Function of mRNA-Encapsulated Lipid Nanoparticles
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由于mRNA固有的不稳定性，其给药途径受到限制，迄今为止仅有注射递送在临床上得到应用。相比之下，口服给药会使mRNA暴露于胃肠道中的多种物质。尽管面临这些挑战，口服给药仍是患者最熟悉且最便捷的途径，因此开发可口服的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA–LNPs）极
由于mRNA固有的不稳定性，其给药途径受到限制，迄今为止仅有注射递送在临床上得到应用。相比之下，口服给药会使mRNA暴露于胃肠道中的多种物质。尽管面临这些挑战，口服给药仍是患者最熟悉且最便捷的途径，因此开发可口服的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA–LNPs）极具吸引力。然而，尚无研究直接考察mRNA–LNPs在胃肠道环境中的受影响情况。在本研究中，研究人员探究了代表性胃肠道组分对mRNA–LNPs的影响。在几种消化酶中，胃蛋白酶显著降低了颗粒的蛋白表达效率，而淀粉酶则无影响。经胃蛋白酶处理的颗粒粒径增大，表明结构改变导致了观察到的功能丧失。高浓度脂肪酶损害了纳米颗粒的功能。由于脂肪酶水解脂质中的酯键，研究人员检测了掺入不含酯键的可电离脂质C12-200替代SM-102的LNPs。C12-200制剂显示出对脂肪酶诱导的功能丧失敏感性降低，表明酶促脂质降解是所观察效应的基础。模拟胃液也显著降低了颗粒功能。对功能与pH值关系的详细分析揭示，功能损伤主要发生在约pH 1的条件下，而在pH ≥ 3时未发生。总之，这些发现确定了损害mRNA–LNP完整性的关键胃肠道因素，并为合理设计可口服的mRNA–LNP制剂提供了重要见解。
论文解读
一、研究背景与目的
基于mRNA的治疗是一种多功能平台，通过在体内表达编码蛋白实现治疗效果，在传染病、癌症和遗传病领域展现出广阔前景。然而，mRNA本身在生理条件下极不稳定，临床制剂必须依赖脂质纳米颗粒（LNPs）进行包裹封装，以提高稳定性和细胞摄取效率。目前临床获批的mRNA-LNP疫苗均采用肌肉注射方式，虽然有效，但存在侵入性强、卫生条件要求高等局限性。口服给药作为非侵入性、方便且受患者欢迎的途径，成为理想选择。然而，胃肠道（GI tract）环境极为严苛，包含剧烈的pH波动和各种消化酶，可能使口服给药的mRNA-LNPs发生不可预测的结构和功能变化，导致活性大幅丧失。此前，传统mRNA-LNPs在小鼠口服后未能检测到蛋白表达，凸显了现有制剂用于口服递送的局限性。尽管已有研究尝试通过组成修饰增强mRNA-LNPs对胃酸或胆汁酸的耐受性，但这些策略仅针对特定有限条件，缺乏对多重消化因子同时作用的全面理解。因此，本研究旨在系统识别胃肠道内影响口服mRNA-LNP稳定性和功能的具体环境因素，为合理设计可口服制剂提供关键依据。
二、研究方法概述
研究人员制备了以SM-102为主要可电离脂质的mRNA-LNPs，并使用模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）以及不同浓度的胃蛋白酶、胆酸、脂肪酶和淀粉酶溶液进行处理。通过动态光散射（DLS）测量粒径和多分散指数（PDI），利用QuantiFluor RNA系统测定包封效率（EE）。采用透射电子显微镜（TEM）观察形态变化。使用琼脂糖凝胶电泳和凝胶渗透色谱（GPC）评估mRNA完整性。在分化的Caco-2和HEK293细胞模型中，通过荧光素酶报告基因检测评估蛋白表达效率，并通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定量分析细胞摄取。此外，还制备了含C12-200或ALC-0315等其他可电离脂质的mRNA-LNPs进行比较研究。
三、研究结果
3.1 SGF对mRNA-LNPs的影响
SGF处理未显著改变颗粒粒径、PDI和包封效率，但荧光素酶表达显著降低，表明颗粒功能受损。
3.2 胃蛋白酶对mRNA-LNPs的影响
胃蛋白酶处理导致粒径随浓度增加而增大，PDI升高，TEM证实形态改变。电泳显示包裹的mRNA出现降解或泄漏。荧光素酶表达降低，流式和CLSM显示细胞摄取减少。结果表明胃蛋白酶通过引起颗粒增大和mRNA降解双重机制降低蛋白表达能力。
3.3 胆汁酸对mRNA-LNPs的影响
胆酸处理导致粒径呈浓度依赖性增大，包封效率急剧下降至约10%，电泳显示残留mRNA完整性未受影响，但蛋白表达显著降低。功能丧失归因于脂质溶解导致的mRNA泄漏。
3.4 脂肪酶对mRNA-LNPs的影响
脂肪酶处理使粒径增大、包封效率下降，电泳显示包裹mRNA完整性保持良好。低浓度脂肪酶反而增强了蛋白表达，而高浓度则显著抑制表达并减少细胞摄取。高浓度脂肪酶通过水解SM-102和DSPC中的酯键破坏颗粒结构和功能。
3.5 脂肪酶对C12-200型mRNA-LNPs的影响
采用不含酯键的C12-200替代SM-102后，脂肪酶引起的包封效率下降幅度减小，各浓度组的蛋白表达无显著差异。结果表明减少颗粒中的酯键可减轻脂肪酶的破坏作用。
3.6 淀粉酶对mRNA-LNPs的影响
淀粉酶处理不影响粒径、形态和包封效率，电泳提示可能有部分表面mRNA降解，但蛋白表达反而随浓度升高而增加，细胞摄取无显著变化。表明淀粉酶对mRNA-LNP功能无不良影响。
3.7 消化酶对ALC-0315型mRNA-LNPs的影响
ALC-0315型颗粒经胃蛋白酶处理后粒径增大，但蛋白表达未显著降低；经胆酸处理后同样出现粒径剧增、包封效率骤降和蛋白表达显著降低；经脂肪酶处理后粒径无明显增大但包封效率下降，蛋白表达呈现低浓度增强、高浓度抑制的模式；经淀粉酶处理后粒径和包封效率不变，但蛋白表达未如SM-102型那样升高。
3.8 pH对mRNA-LNPs的影响
pH 1的强酸性条件显著降低蛋白表达，而pH ≥ 3时无影响。延长处理时间进一步加剧pH 1条件下的功能丧失。但不同pH条件下细胞摄取无显著差异。
3.9 pH对mRNA完整性的影响
SGF（pH 1.2）处理导致mRNA完全降解，电泳条带消失，GPC显示洗脱延迟；而SGF（pH 3）或PBS处理组mRNA保持完整。表明强酸性条件下包裹mRNA的降解是功能丧失的主要原因。
四、讨论与结论
讨论总结： 本研究系统揭示了胃肠道关键组分对mRNA-LNP功能的影响。SGF的破坏作用主要源于极端酸性条件（pH 1），而pH ≥ 3时功能不受影响，提示提高胃内pH至3以上可能是保护mRNA-LNPs的有效策略。胃蛋白酶和胆汁酸通过作用于脂质成分而非直接降解RNA来损害功能，因此采用聚合物涂层等物理屏障防止接触是可行的保护方案。脂肪酶的作用呈双相性：低浓度可能通过部分脂质重塑改善内涵体逃逸从而增强表达，高浓度则通过水解酯键造成严重破坏。采用不含酯键的可电离脂质C12-200可显著减轻这种破坏。淀粉酶基本无害甚至可能增强表达，但其效果依赖于脂质组成。
研究结论翻译： 本研究是开发可口服mRNA-LNPs的初步探索。据研究人员所知，这是首次系统考察单个胃肠道组分对mRNA-LNP功能影响的报道。本研究的发现确定了口服mRNA-LNP递送的关键障碍，并为制定保护策略以减轻mRNA-LNPs在胃肠道中的失稳提供了理性依据。然而，未来的研究应评估此类制剂的体内有效性和安全性，以确保其临床适用性。
