芥末酱中产气腐败菌的分离鉴定及其生长控制方法研究

《Food Science & Nutrition》：Isolation and Identification of Gas-Producing Spoilage Bacteria in Wasabi Sauce and Effective Methods for Controlling Their Growth

　　

芥末酱中产气腐败菌的存在可导致产气缺陷，严重损害产品质量，并造成潜在食品安全危害——这些问题在调味品行业中已日益紧迫。本研究旨在分析芥末酱在保质期内产气后的品质变化，分离并鉴定产气菌，并提出抑制其生长的有效方法。在厌氧条件下分离出的产气腐败菌被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）QJL3。该菌株耐高盐浓度和中等热度，但对强酸条件敏感：在4°C和55°C处理10 min后仍能存活，可在低至pH 3.8的条件下生长，在14%盐浓度下完全抑制其生长。抑制分析表明，当盐浓度达到8%时，地衣芽孢杆菌QJL3在酵母提取物蛋白胨葡萄糖腺嘌呤培养基（yeast extract peptone dextrose adenine medium，YPDA）液体培养基中的生长可被有效抑制，山梨酸钾的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为0.2 mg/mL。这些发现为芥末酱生产商实施有针对性的微生物控制措施、提高产品稳定性和确保食品安全提供了有价值的见解。

芥末酱是一种以辣根（Armoracia rusticana）为主要原料的调味品，天然含有硫代葡萄糖苷，经芥子酶水解后产生异硫氰酸酯，赋予其独特风味和抑菌特性。传统芥末酱通常具有较低pH（4.8–5.2）和较高盐浓度（约10%–12%，w/v），不利于细菌生长。然而，随着全球减盐政策和公众健康意识的提升，中国计划到2030年将人均盐摄入量降低20%，芥末酱生产商因此降低配方中的盐浓度，导致产气腐败问题偶发，表现为包装胀包、酸败异味等品质缺陷。产气缺陷在辣椒酱、豆酱、腐乳、酱油和奶酪等食品中已有报道，主要由产气微生物污染引起。目前已有多种腐败菌被分离鉴定，并开发了相应的控制策略，但不同食品体系中效果差异较大。因此，系统分离鉴定芥末酱中的产气菌、研究其特性及控制措施，对提高芥末酱货架期稳定性和食品安全至关重要。

研究人员从山东某调味品厂获取正常（ZC1、ZC2、ZC3）和胀包（CQ1、CQ2、CQ3）芥末酱样品，分析了其感官、理化指标和抗氧化活性，并通过可培养法和杜氏管（Durham tube）试验分离产气菌。结合形态学、生理生化鉴定（VITEK 2系统）和16S rDNA分子鉴定，将主要产气菌鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）QJL3。进一步评估了该菌株对温度、pH和盐度的耐受性，并系统测定了乳酸链球菌素（nisin）、山梨酸钾、苯甲酸钠及盐对其生长的抑制作用，确定了最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。研究结果显示，QJL3对中等温度和较高盐浓度具有耐受性，但对强酸敏感；在8%盐浓度下，山梨酸钾的MIC为0.2 mg/mL，能有效抑制其生长。该研究为芥末酱生产企业抑制产气腐败菌、提升产品稳定性提供了理论依据和实用策略。

技术方法上，研究人员使用了以下主要方法：样品来自山东某食品公司的6份芥末酱（3份正常、3份胀包）。采用银量滴定法测定盐含量，氢氧化钠滴定法测定总酸和氨基酸态氮，蒽酮比色法测定可溶性糖，燃烧法测定蛋白质，pH计和直接干燥法分别测定pH和水分。抗氧化成分（总酚、黄酮、抗坏血酸）按试剂盒测定，抗氧化活性通过DPPH、ABTS和羟自由基清除率评价。微生物分离采用玫瑰红琼脂（RBM）、平板计数琼脂（PCA）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和YPDA四种培养基，分别在需氧和厌氧条件下培养，并通过杜氏管筛选产气菌。菌株鉴定采用VITEK 2自动微生物鉴定系统及16S rDNA PCR扩增和系统发育树分析。环境耐受性通过不同温度、pH和盐浓度下的生长测定（OD₆₀₀）评价。抑菌实验在YPDA液体培养基中进行，采用不同浓度的nisin、山梨酸钾和苯甲酸钠，结合8%盐浓度测定MIC。

**3.1 理化与感官特性比较**：与正常样品相比，胀包芥末酱表现为包装膨胀、颜色变褐、辛辣味减弱并伴有腐败气味，滋味变酸涩。理化指标上，胀包样品总酸和pH显著升高，盐含量、氨基酸态氮、水分、蛋白质和可溶性糖显著降低。这表明微生物污染分解了糖和蛋白质，产生二氧化碳和酸性物质，导致品质劣变。

**3.2 抗氧化成分与活性比较**：胀包样品的总酚含量显著高于正常样品，而黄酮和抗坏血酸含量显著降低。尽管黄酮和抗坏血酸减少，但胀包样品的DPPH、ABTS和羟自由基清除活性均显著增强，研究人员认为可能是微生物代谢生成了具有抗氧化活性的新物质，或破坏基质结构释放了胞内抗氧化成分，导致总体抗氧化能力提高。

**3.3 主成分分析（PCA）**：PCA结果显示PC1和PC2分别解释85.79%和10.22%的方差，累计96.01%。胀包样品与总酸、pH、总酚和抗氧化活性呈强正相关，与可溶性糖呈负相关。聚类热图进一步表明，正常样品与胀包样品在理化成分、功能活性物质和抗氧化活性方面存在显著差异，说明产气腐败显著降低了芥末酱品质，即使仍在保质期内也不建议食用。

**3.4 产气腐败菌的分离与鉴定**：在厌氧条件下，胀包样品在YPDA培养基上长出6个菌落，在PCA和TSA上分别长出4个菌落，而需氧培养无生长，RBM培养基无霉菌生长，排除了霉菌污染。根据菌落形态差异纯化得到5株菌株QJL1–QJL5，杜氏管试验显示仅QJL3在24 h内产气。QJL3菌落圆形、乳白色、直径2–4 mm，细胞呈杆状、革兰氏阳性。VITEK 2生化鉴定显示其能代谢葡萄糖、半乳糖、麦芽三糖和甘露糖产酸产气，并具有多种芳基酰胺酶活性。16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌相似性达96%，系统发育树聚于同一分支，最终将QJL3鉴定为B. licheniformis QJL3。

**3.5 产气菌的环境耐受性**：QJL3在25°C时生长最佳，经4°C和55°C处理10 min后仍能存活，具有较强的中和热耐受性。在pH 3.6时生长极弱，随pH升高生长逐渐增强，最适pH为5.6，表明其耐酸能力有限。盐度试验显示，JQJL3在12%盐浓度下仍能生长并产气，但在14%盐浓度下完全被抑制，说明其耐高盐但对强酸敏感。这些特性使其能在芥末酱常规储存条件下生存并导致胀包。

**3.6 nisin、防腐剂和盐对B. licheniformis QJL3的抑制作用**：在无盐条件下，山梨酸钾对QJL3的MIC为1 mg/mL，苯甲酸钠为4 mg/mL，而nisin无抑制效果。当盐浓度达到8%时，山梨酸钾的MIC降至0.2 mg/mL，苯甲酸钠降至0.6 mg/mL。研究表明，山梨酸钾与8%盐联用可有效抑制QJL3生长，且0.2 mg/mL的MIC低于中国、欧盟和美国的最低使用标准。单独使用14%以上盐虽可抑制微生物，但不符合减盐健康政策；而8%盐结合山梨酸钾既能控制腐败菌，又满足减盐趋势。

综合讨论认为，产气腐败导致芥末酱理化品质显著下降，虽然抗氧化活性升高，但整体质量已不适合消费。地衣芽孢杆菌QJL3作为主要产气菌，对中等热度、低pH和高盐的耐受性使其能在芥末酱中存活并引起胀包。在YPDA培养基中，8%盐浓度可显著增强山梨酸钾和苯甲酸钠的抑菌效果，其中山梨酸钾更为高效。该研究结论指出，B. licheniformis QJL3是导致芥末酱产气缺陷的主要微生物；使用8%盐浓度结合山梨酸钾可有效控制其生长，该方案显著低于传统10%–12%盐量，符合公共健康减盐政策，同时为生产商降低经济损失、提高产品质量提供了理论依据和实践策略。未来研究应聚焦在实际生产中山梨酸钾的最佳添加剂量，以保证产品稳定性并保留传统感官特性。