《Food Science & Nutrition》：Sulfation Rewrites the Biological Profile of Dietary Flavonoids: Implications for Stability, Redox Signaling, and Inflammation
编辑推荐：
专业术语翻译（摘要部分）
膳食黄酮类化合物（flavonoids）经历广泛的Ⅱ相代谢，然而硫酸化（sulfation）对其生物学活性的功能影响仍知之甚少。本研究比较了九种结构多样的黄酮类化合物及其硫酸化衍生物的理化性质和细胞效应。利用细菌芳基磺基转移酶（ary
专业术语翻译（摘要部分）
膳食黄酮类化合物（flavonoids）经历广泛的Ⅱ相代谢，然而硫酸化（sulfation）对其生物学活性的功能影响仍知之甚少。本研究比较了九种结构多样的黄酮类化合物及其硫酸化衍生物的理化性质和细胞效应。利用细菌芳基磺基转移酶（aryl sulfotransferase）酶促制备了黄酮类化合物3′-O-或4′-O-硫酸盐，经结构确认后，研究人员将其评估为人胞质磺基转移酶（sulfotransferases, SULTs）可能形成的代谢产物。结果表明，硫酸化显著提高了在生理相关条件下原本不稳定的黄酮类化合物的稳定性，同时普遍降低了其抗自由基能力及对小鼠RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性。与未硫酸化的黄酮类化合物（尤其是非瑟酮（fisetin）和槲皮素（quercetin））相比，所有 tested 黄酮硫酸盐均未能激活RAW264.7细胞中的NRF2（核因子E2相关因子2，nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2）通路。另一方面，部分母体黄酮类化合物及黄酮硫酸盐可部分减弱脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达，表明硫酸化代谢产物保留了调节炎症反应的能力。利用重组人磺基转移酶，研究人员鉴定了负责形成所测硫酸盐的多种酶，证实其作为合理代谢产物的相关性。总体而言，研究结果表明，代谢性硫酸化深刻重塑了黄酮类化合物的稳定性与生物学活性，强调了在评估膳食黄酮类化合物健康效应时考虑结合型代谢产物的重要性。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
膳食黄酮类化合物（flavonoids）是植物中广泛存在的一大类结构多样的次生代谢产物，由两个苯环（A环和B环）通过杂环C环连接而成。流行病学研究表明，富含黄酮类化合物的饮食与心血管疾病风险降低存在一致性关联。然而，理解这些健康益处的分子基础需要超越食物中母体化合物的性质，因为膳食黄酮类化合物在摄入后经历广泛的代谢转化。在人体内，膳食黄酮类化合物经肠道菌群和宿主组织（尤其是肠道和肝脏）的广泛代谢，脱糖基化后的苷元通过Ⅱ相反应（包括硫酸化、葡萄糖醛酸化和甲基化）迅速结合。因此，循环中母体黄酮类化合物的浓度极低，通常仅在纳摩尔范围；相反，结合型代谢产物（尤其是葡萄糖醛酸苷和硫酸盐）达到显著更高的浓度，并在血浆中持续数小时。例如，一项最新的人体药代动力学研究显示，口服槲皮素后，单硫酸盐、单葡萄糖醛酸苷以及同时带有葡萄糖醛酸和硫酸基团的杂合结合物是主要的循环物种。
尽管葡萄糖醛酸苷通常被认为是外源物代谢产物的主要类型，但研究聚焦于黄酮硫酸盐基于以下考量：具有足够磺基转移酶（sulfotransferases, SULTs）表达的组组（如肠上皮）可能产生相当数量的黄酮硫酸盐；黄酮硫酸化可能发生在与葡萄糖醛酸化不同的羟基位点，从而赋予不同于葡萄糖醛酸苷的生物学活性；新近证据表明黄酮硫酸盐可通过炎症部位磺酸酯酶的作用充当生物活性苷元的储库；此外，单个黄酮硫酸盐生物活性信息的缺乏是理解黄酮代谢-活性关系的关键知识空白。因此，本研究旨在系统考察黄酮硫酸化对理化性质和生物学活性的影响，包括抗氧化能力、细胞毒性以及与NRF2和NF-κB通路的相互作用。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员比较了九种代表主要黄酮类别的黄酮类化合物（apigenin、naringenin、hesperetin、fisetin、quercetin、myricetin、taxifolin、ampelopsin和genistein）及其相应的单硫酸盐。硫酸化发生在B环的3′-OH或4′-OH位置。其中四种新硫酸盐（apigenin-4′-O-硫酸盐、fisetin-3′-O-硫酸盐、genistein-4′-O-硫酸盐和hesperetin-3′-O-硫酸盐）为首次合成，利用来自Desulfitobacterium hafniense的芳基磺基转移酶（dhAST）酶促制备。主要关键技术方法包括：紫外-可见吸收光谱法评估化合物稳定性；DPPH自由基清除实验测定抗自由基活性；MTT法评估RAW264.7小鼠巨噬细胞（购自ECACC, Salisbury, UK）的细胞毒性；定量实时PCR和Western blot分析NRF2通路相关基因（Hmox1、Nqo1、Nfe2l2）及炎症标志物（Ptgs2/Cox2、Nos2）的mRNA和蛋白表达；以及利用重组人磺基转移酶（SULT1A1 * 1、1A1 * 2、1A2、1A3、1B1、1C2、1C4、1E1和2A1，来源于Cypex, Dundee, UK）结合LC-MS分析鉴定负责黄酮硫酸化的人体酶。
三、研究结果
3.1 黄酮硫酸盐的合成
研究人员利用重组dhAST和p-硝基苯基硫酸酯（p-NPS）作为硫酸基供体，成功制备了四种新型黄酮硫酸盐，分离产率为8%–29%，纯度达96%–100%。通过质谱（MS）确认硫酸化，利用1H和13C核磁共振（NMR）进行结构归属。由于羟基信号较宽导致诊断性HMBC相关不可观测，硫酸盐位置通过相对于母体黄酮的碳化学位移特征性变化间接确定。
3.2 所测黄酮类化合物的吸收光谱
黄酮类化合物在甲醇中的吸收光谱显示，含有2,3-双键且B环位于C2的黄酮类化合物（apigenin及flavonols fisetin、quercetin、myricetin）通常显示两个主要紫外-可见吸收峰：带Ⅱ（240–295 nm）对应A-C环的苯甲酰系统，带Ⅰ（300–400 nm）对应B-C环的肉桂酰系统。缺乏2,3-双键的flavanones（naringenin、hesperetin）、flavanonols（taxifolin、ampelopsin）以及B环位于C3的isoflavone genistein仅显示对应于带Ⅱ的单一最大吸收峰。硫酸化改变了多种黄酮的吸收特性，其中apigenin和quercetin的硫酸盐吸收峰位移最为显著。
3.3 所测黄酮类化合物的稳定性
在细胞培养相关条件（磷酸盐缓冲液，pH 7.4，37°C）下孵育24小时后，apigenin、naringenin、hesperetin、taxifolin、genistein及其硫酸盐保持稳定，保留>94%的初始浓度。相反，其余母体黄酮不稳定，稳定性按ampelopsin > fisetin > quercetin > myricetin顺序递减。flavonols是最不稳定的亚类，不稳定性与羟基数目相关。硫酸化显著改善了这些不稳定黄酮的稳定性：3小时后，myricetin-3′-O-硫酸盐和quercetin-3′-O-硫酸盐分别保留55%和92%的初始浓度，而fisetin-3′-O-硫酸盐和ampelopsin-4′-O-硫酸盐未见损失。这表明单个羟基的硫酸化可显著影响黄酮稳定性。
3.4 所测黄酮类化合物的抗自由基活性
DPPH实验表明，apigenin、naringenin、genistein及其硫酸盐在1–50 μM范围内自由基清除能力可忽略。六种未硫酸化黄酮具有活性，效力按fisetin ≈ myricetin > quercetin > ampelopsin > taxifolin >> hesperetin递减，EC50值为3.4–9.7 μM，凸显了儿茶酚或连苯三酚B环及2,3-双键的重要性。硫酸化显著降低了抗自由基活性：fisetin-3′-O-硫酸盐、quercetin-3′-O-硫酸盐和myricetin-3′-O-硫酸盐保留了DPPH清除能力但EC50值显著升高；而taxifolin、ampelopsin和hesperetin的硫酸化完全消除了DPPH清除效应。这表明硫酸化黄酮保留抗自由基活性取决于2,3-双键的存在和/或硫酸化位置。
3.5 所测黄酮类化合物对RAW264.7细胞的细胞毒性
MTT实验显示，naringenin、hesperetin、taxifolin及其硫酸盐无或仅有轻微细胞毒性。ampelopsin、myricetin和quercetin中度降低细胞活力至74%–79%。最强的细胞毒性见于apigenin、genistein和fisetin，在50 μM时分别将细胞活力降至33%、48%和52%。其硫酸化衍生物的细胞毒性显著降低，apigenin-4′-O-硫酸盐、genistein-4′-O-硫酸盐和fisetin-3′-O-硫酸盐分别维持85%、66%和93%的细胞活力。总体而言，B环硫酸化可显著降低黄酮细胞毒性。
3.6 所测黄酮类化合物对RAW264.7细胞NRF2通路的影响
在50 μM处理4小时的条件下，fisetin和quercetin显著诱导Hmox1 mRNA（分别为8.4倍和4.9倍），伴随Nqo1 mRNA的中度升高；hesperetin引起Hmox1和Nqo1表达的轻微增加（分别为2.8倍和1.4倍）。相反，apigenin、naringenin、myricetin、taxifolin、ampelopsin、genistein以及所有黄酮硫酸盐均未能诱导Hmox1或Nqo1 mRNA。蛋白水平上，fisetin和quercetin上调HO-1蛋白，伴随NRF2积累和KEAP1蛋白水平降低。值得注意的是，所有测试的黄酮硫酸盐均未能在RAW264.7细胞中诱导NRF2依赖性表达，表明硫酸化完全消除了NRF2通路激活能力。
3.7 所测黄酮类化合物对LPS刺激RAW264.7细胞COX-2和iNOS表达的影响
在LPS刺激的RAW264.7细胞模型中，genistein和myricetin-3′-O-硫酸盐显著降低LPS诱导的Ptgs2 mRNA表达；fisetin、apigenin、quercetin和myricetin-3′-O-硫酸盐显著抑制Nos2 mRNA。蛋白水平上，大多数测试化合物部分降低LPS诱导的COX-2蛋白水平，其中fisetin、quercetin和taxifolin-4′-O-硫酸盐效果最强；所有黄酮均降低LPS诱导的iNOS水平，apigenin和genistein的效果与地塞米松相当。myricetin-3′-O-硫酸盐比母体化合物更有效，而taxifolin-4′-O-硫酸盐和myricetin-3′-O-硫酸盐总体为弱调节剂。研究指出，硫酸化黄酮由于硫酸基团在生理pH下离子化而显著降低被动膜通透性，其细胞内浓度可能低于名义培养基浓度，因此其效力可能被低估。
3.8 人磺基转移酶参与黄酮生物转化
研究人员将母体黄酮与重组人SULTs孵育后经LC-MS分析，所有化合物均可被多种SULT酶有效硫酸化，硫酸化产物数量从hesperetin的两种到ampelopsin的六种不等。对酶促硫酸化的敏感性按ampelopsin > apigenin > genistein ≈ naringenin ≈ hesperetin > quercetin ≈ fisetin > myricetin递减。仅产生单硫酸化代谢产物。SULT1C4对测试黄酮表现出最高的总体活性（hesperetin除外，其优先被SULT1A3和1E1硫酸化）。SULT1E1产生大多数硫酸盐的最高产量。鉴于SULT1A1、1A3、1B1和1E1在小肠和肝脏中表达，这些黄酮硫酸盐可被视为合理的人体代谢产物。
3.9 综合结构-性质-活性关系（SAR/SPAR）分析
综合五个终点（稳定性、DPPH抗自由基活性、细胞毒性、NRF2通路激活和抗炎反应），2,3-双键和3-OH基团与儿茶酚或连苯三酚B环的组合是影响最大的结构决定因素，赋予flavonols（尤其是fisetin和quercetin）高抗自由基活性、NRF2激活能力和Nos2 mRNA抑制效应，但代价是生理pH下的显著不稳定性。硫酸化的效应因终点而异：最显著的是，硫酸化在所有九种黄酮中均禁止NRF2通路激活，与母体效力或硫酸化位置无关；这与抗炎活性形成对比，硫酸化产生包括减弱、保留甚至增强的一系列结果。硫酸化一致地稳定了所有不稳定黄酮。对于DPPH清除，hesperetin、taxifolin和ampelopsin的硫酸化完全消除抗自由基活性，而fisetin、quercetin和myricetin的3′-O-硫酸化仅部分降低效应。
四、讨论总结与研究结论
研究讨论指出，代谢性硫酸化是黄酮在生理相关条件下行为的关键决定因素。区域选择性硫酸化显著增强不稳定黄酮的稳定性，同时减弱其抗自由基能力、细胞毒性和NRF2通路激活能力。同时，多种黄酮硫酸盐保留调节LPS诱导炎症反应的能力，表明硫酸化代谢产物并非生物学惰性。从营养学角度看，母体黄酮与其硫酸化结合物之间稳定性的显著差异表明，膳食黄酮摄入后到达体循环和外周组织的分子种类与食物中存在的形式根本不同。槲皮素和fisetin等flavonols在生理pH下固有地不稳定，但B环硫酸化使其稳定，表明硫酸化在全身分布过程中保留了其发挥生物学效应的潜力。相反，硫酸化导致NRF2激活能力丧失，证明代谢不仅减弱活性，还可定性改变膳食黄酮的生物学效应。鉴于最新药代动力学数据显示槲皮素单硫酸盐和杂合结合物是人类膳食摄入后主要的循环物种，硫酸化代谢产物调节COX-2和iNOS表达的能力与理解富含黄酮饮食与慢性炎症性疾病风险降低之间的流行病学关联相关。研究结论强调，将硫酸化结合物纳入黄酮的机制和营养学研究十分必要，并为更准确解释其在体内的生物学效应提供了框架。研究局限性在于未直接考察对NF-κB及其他炎症信号通路的影响，也未测定测试化合物的细胞内浓度；由于硫酸化降低被动膜通透性，硫酸化黄酮与母体黄酮的相对效力可能被低估。
