人血小板裂解物（hPL）支持人乳腺组织来源脂肪干细胞（ADSCs）的三维培养

《Stem Cells International》：The Use of Human Platelet Lysate (hPL) Enables 3D Cultivation of ADSCs Derived From Human Breast Tissue

　　

摘要 背景：对于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在再生医学中的应用，无异源（xeno-free）的体外培养是必要的。因此，本研究旨在探讨人乳腺组织来源的脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）是否能够使用人血小板裂解物（human platelet lysate, hPL）——一种来源于人血小板的、有前景的替代物——代替胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）进行培养。 方法：研究人员分析了hPL对女性乳腺来源ADSCs培养基中免疫表型、成脂分化能力、生长动力学及细胞周期分布的影响。随后，对hPL补充培养基中球体（spheres）的形成进行了详细表征。 结果：与FBS相比，hPL补充培养基导致细胞形态发生变化，但免疫表型保持不变。此外，hPL补充培养基使ADSCs的成脂分化能力提高、生长加速、群体倍增时间（population doubling time, PDT）缩短。另外，使用hPL培养ADSCs可导致球体的自发形成。 结论：hPL不仅是具有伦理争议的细胞培养添加剂FBS的替代品，而且为乳腺组织来源ADSCs的培养提供了一种无异源的方法，因此代表了从实验室到临床（bench to bedside）的重要一步。

论文解读：人血小板裂解物（hPL）实现人乳腺组织来源脂肪干细胞（ADSCs）的三维培养

一、研究背景与意义

脂肪组织于2002年被确认为间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的新来源。所谓脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）符合国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy, ISCT）2006年立场声明所定义的多能间充质基质细胞标准：贴壁生长、表达特定CD标志物（CD105、CD90和CD73）、具备自我更新能力，并可向成骨、成软骨和成脂谱系分化。因此，ADSCs可用于再生医学的治疗目的，如通过植入小鼠体内的ADSCs促进膝关节软骨和耳软骨的再生，植入的ADSCs通过细胞因子和生长因子刺激组织并增强血管生成。

在体外细胞培养中，血清被用作细胞生长所需的生长因子、激素、转运蛋白和其他蛋白质的来源。目前，大多数研究者使用胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）培养细胞，包括ADSCs。FBS的年使用量约为500,000升，来源于肉牛生产群中怀孕母牛的胎牛，通过心脏穿刺获取。使用FBS存在诸多缺点：临床应用中可能引起患者过敏反应；FBS成分不明确，存在批次间差异；可能被细菌、病毒、真菌、酵母和内毒素污染；且穿刺时胎牛未接受麻醉处理，存在伦理问题。因此，寻找FBS的替代物成为必要。

2005年，Doucet等人描述了在MSCs培养中使用人血小板裂解物（human platelet lysate, hPL）。hPL具有多项优势：由于来源于人类，能更好地模拟细胞的天然微环境，治疗过程中不会引起人类过敏反应；可利用血库中过期的血液制品（如全血和血小板浓缩物）生产，不存在患者护理中的伦理问题；白细胞去除过滤器也可作为血小板的来源。由于hPL培养基因其纤维蛋白原含量易发生胶凝化，需在培养基中添加肝素作为拮抗剂。hPL可能的病毒污染可通过献血后的两次检测排除。

已有研究表明，来自腹部脂肪组织的ADSCs可在hPL培养基中成功培养。但据研究人员所知，尚无关于hPL是否能作为人乳腺组织来源ADSCs培养中FBS替代品的研究。乳腺组织来源的ADSCs与腹部脂肪来源的ADSCs虽有许多相似之处——如可比的形态学和表型特征、相似的细胞表面表型、多谱系分化能力和可比的基因表达谱——但两者在关键特征上存在明显差异。乳腺组织来源的ADSCs受其微环境影响而具有独特性质：与腹部脂肪组织来源的ADSCs相比，乳腺组织来源的ADSCs表现出更高的集落形成潜力和成骨分化细胞中更高的骨钙素表达水平；具有更优越的免疫调节和抗氧化能力；在体外表现出更大的自我更新潜力。因此，推测与腹部脂肪组织来源的ADSCs相比，乳腺来源的ADSCs有更高几率维持和扩增其干细胞群体，因为更多细胞保持未分化状态。

本研究的目的是探讨hPL是否能作为人乳腺组织来源ADSCs体外细胞培养中FBS的合适替代品，这将使无异源（xeno-free）体外培养成为可能，而这是乳腺来源ADSCs在再生医学中应用所必需的，以避免过敏反应或污染。

二、主要技术方法

本研究使用的ADSCs分离自接受乳房缩小术的健康女性乳腺组织，经5%二甲基亚砜（DMSO）于?150°C冻存。该分离方案已获德国罗斯托克大学医学中心伦理委员会批准（注册号：A2017-0049）。每次实验使用来自10名捐献者的混合ADSCs（pooled ADSCs），研究人员已证明混合ADSCs（n=10）的研究结果与各捐献者单独分析的平均值相当。主要技术方法包括：流式细胞术进行免疫表型分析（检测CD31、CD45、CD106、CD29、CD34和CD90等表面标志物）；成脂分化诱导后油红O（Oil Red O）染色及异丙醇提取定量；每日细胞计数绘制生长动力学曲线并计算群体倍增时间（population doubling time, PDT）；碘化丙啶染色结合流式细胞术进行细胞周期分析；球体形成过程中显微镜观察与形态学分期；von Kossa染色和阿尔辛蓝（Alcian Blue）染色排除成骨和成软骨分化；流式细胞术检测SSEA-3阳性细胞亚群（即MUSE细胞）。

三、研究结果

3.1 ADSCs的特征

3.1.1 hPL培养期间ADSCs形态改变，免疫表型不变

ADSCs以其纺锤形和成纤维细胞样形态以及特定表面抗原表达谱（CD29?、CD90?、CD31?、CD34?、CD45?、CD106?）为特征。在hPL培养基中，ADSCs也呈纺锤形外观，但细胞体比FBS培养中的更长更窄。对培养2天后50个ADSCs的定量分析显示，FBS中细胞大小为194.04 ± 53.65 μm，10% hPL中为112 ± 39.27 μm，2.5% hPL中为137.97 ± 61.64 μm。表面蛋白的特异性表达模式在hPL培养中与FBS培养相比没有变化，与传代次数（三代或五代）无关。

3.1.2 成脂分化能力提高

在FBS（ADSCs-FBS）或hPL（ADSCs-hPL）中培养的ADSCs在施加适当诱导培养基后均保持了成脂分化能力。ADSCs-FBS在加入成脂分化培养基约120小时后开始形成细胞内脂滴；而hPL-ADSCs中这一过程提前24小时开始。此外，hPL-ADSCs中分化细胞的总比例更高（hPL: 35.5% vs. FBS: 30.1%，p ≤ 0.05）。从先前在hPL中培养的分化ADSCs中提取的油红O染料量也呈更高趋势（hPL: 0.61 vs. FBS: 0.45）。

3.2 生长动力学

3.2.1 hPL培养基中ADSCs细胞生长增强

ADSCs-FBS（10% FBS）在接种后前24小时内进入延迟期，对数期始于48小时，120小时后结束，群体倍增时间（PDT）为52.37小时。120小时时增殖停滞并达到平台期。省略换液时，对数期在接种后仅96小时即结束，PDT增至63.35小时。相比之下，ADSCs-hPL（10% hPL）以增强的细胞生长速率为特征（PDT FBS: 52.37 h vs. PDT hPL: 36.55 h），且无需换液即可在7天内维持连续对数生长。较低的hPL浓度导致细胞生长下降，PDT从36.55小时增至65.48小时（有换液）或70.14小时（无换液）。

3.2.2 细胞周期分布

在接种后72小时时间点，hPL培养的ADSCs与FBS相比，S期细胞比例增加（hPL: 7.23% vs. FBS: 2.08%，p ≤ 0.05），G2/M期细胞比例增加（hPL: 16.04% vs. FBS: 8.24%，p ≤ 0.05），而G0/G1期细胞比例降低（hPL: 73.61% vs. FBS: 88.17%，p ≤ 0.01）。换液增强了这一趋势。然而，为维持S期细胞的稳定比例，hPL培养中仅在168小时后才需要换液。72小时后的换液反而导致细胞周期进程的短期抑制，S期细胞比例从7.23%（72小时）降至3.94%（120小时，有换液）。

3.3 球体的表征

3.3.1 球体形成

在FBS培养基中，ADSCs以二维（2D）方式平铺生长。而在hPL补充培养基中，ADSCs自发形成三维（3D）结构（球体）。培养48小时后，贴壁细胞成群迁移并呈星形排列；随后这些2D复合物开始重叠并组织成3D堆状聚集，直至形成球体；最后一步，球体从培养皿底部脱离并在培养基中自由漂浮。通过von Kossa染色（成骨细胞）和阿尔辛蓝染色（软骨细胞）排除了自发分化为成骨或软骨细胞的可能性。

在不同培养条件下分析球体形成：在2×10?及更高的接种密度下，ADSC球体形成在培养仅48小时后即开始；而在较低接种密度（5×103和1×10?）下，球体形成延迟。第1阶段球体最为常见，其次是第2和第3阶段，第4阶段形成在分析中计数最少。培养基中不添加hPL时几乎检测不到球体形成。球体形成在2.5% hPL培养的ADSCs中最为显著，随着hPL浓度增加（5%、10%和20%），球体形成逐渐减少。比较两个传代时，第3代和第5代的球体形成分布模式相似，但较高传代中总体上可检测到更多球体。

3.3.2 ADSCs中的SSEA-3亚群

SSEA-3由ADSCs的一个亚群表达，即所谓的MUSE细胞（multilineage-differentiating stress-enduring cells，多系分化应激耐受细胞），被认为可能负责启动球体形成。人乳腺来源的ADSCs在FBS和hPL补充培养基中均表达SSEA-3。SSEA-3阳性细胞比例在第2代为0.46%（FBS）和1.69%（hPL），第5代为1.23%（FBS）和0.13%（hPL）。第5代hPL培养的球体中含有0.78%的SSEA-3阳性细胞，而贴壁细胞中也含有0.26%的SSEA-3阳性ADSCs。

四、讨论与结论

讨论部分总结：本研究分析了hPL与FBS作为人乳腺组织来源ADSCs培养基补充剂的效应。在hPL培养基中，乳腺ADSCs呈现更窄的纺锤形细胞体和更长的细胞突起，与腹部脂肪ADSCs在hPL中的形态变化相似。免疫表型在hPL培养中保持不变。hPL培养的ADSCs成脂分化能力更强，脂滴形成提前24小时，分化细胞比例显著更高。hPL培养的ADSCs生长速率增加，PDT为36.55小时，而FBS培养为52.37小时，且无需换液即可维持7天连续对数生长。即使将hPL浓度降至2.5%，仍可获得比10% FBS显著更高的细胞数。细胞周期分析显示hPL培养中S期和G2/M期细胞比例约为FBS培养的3倍和2倍。hPL培养中ADSCs在约96小时后自发形成球体，无需额外辅助方法，而FBS培养中即使改变接种密度和血清浓度也未观察到球体形成。球体大小受hPL浓度和接种密度影响，低hPL浓度（2.5%和5%）下球体数量更多，与高hPL浓度（10%）下的增殖优势呈相反剂量-反应关系。hPL中生长因子（如bFGF、EGF、PDGF及其异构体AA、AB、BB和TGF-β）浓度显著高于FBS。球体来源的MSCs因其更高的分化能力和更强的抗炎、促血管生成和促有丝分裂效应而被认为更具治疗应用前景。SSEA-3阳性MUSE细胞在球体和贴壁细胞中均有发现，尚不能明确其是否为球体形成的起始细胞。

结论翻译：总体而言，基于所呈现的数据，研究人员能够证明hPL作为培养基补充剂在乳腺ADSCs细胞培养中代表了FBS的一种有前景的替代品。因此，其使用不仅在临床治疗的体外扩增中是可行的，在组织工程领域也是如此。关于这一主题还需要进一步研究。研究人员还证明，使用hPL可以在无需特殊方法（如悬滴法或用琼脂糖包被孔板或低附着板等外部强制球体形成的材料）的情况下生成ADSC球体。然而，关于球体形成仍需进一步研究。