Marstacimab（PF-06741086）治疗后人血浆中游离组织因子途径抑制剂（TFPI）定量分析的挑战

《The AAPS Journal》：Challenges in the Quantification of Free TFPI in Human Plasma Following Marstacimab Treatment

　　

组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）是外源性凝血途径的内源性抑制剂。Marstacimab（PF-06741086）是一种人免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1, IgG1）单克隆抗体，其与TFPI的Kunitz-2结构域结合，以改善血友病患者的止血控制。定量游离型TFPI（即未与marstacimab或内源性结合蛋白结合的TFPI）是评估治疗后靶点占据与调节作用最直接的方法。本研究描述了为支持marstacimab药物开发项目而开发定量检测人血浆中游离TFPI方法的探索。研究人员将三种蛋白质富集方法（竞争性抗体捕获、结合伴侣捕获及药物耗竭）与液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MSMS）相结合，以建立生物分析游离靶点检测方法。表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）用于测定marstacimab和竞争性抗体克隆与TFPI的结合亲和力。SPR分析显示，marstacimab以纳摩尔级亲和力结合TFPI（平衡解离常数[K_D]为3.7 nM），而抗体克隆对TFPI具有皮摩尔级结合亲和力。在本研究所报道的实验条件下，所有检测形式均过度回收了TFPI，表明样品处理过程中marstacimab:TFPI复合物被破坏并释放了已结合的TFPI。因此，准确测定游离TFPI不可行。这些发现表明，分析所需的样品操作改变了marstacimab:TFPI复合物的结合平衡，导致已结合TFPI释放，从而损害了检测的特异性。总之，在检测的方法中，无法从经marstacimab处理的人血浆中准确测定游离TFPI，部分原因是marstacimab以低纳摩尔级亲和力结合TFPI。

论文解读

一、研究背景与目的
人体凝血由外源性和内源性途径精密调节。组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）是外源性凝血途径的内源性抑制物，可灭活活化凝血因子X（activated coagulation factor X, FXa）和活化凝血因子VII（activated coagulation factor VII, FVIIa）。血友病A/B分别因凝血因子VIII（factor VIII, FVIII）或IX（factor IX, FIX）缺乏导致出血，但持续出血还与TFPI的存在有关。Marstacimab（PF-06741086）是人免疫球蛋白G1（immunoglobulin G1, IgG1）单克隆抗体，靶向TFPI的Kunitz-2结构域，已获批用于伴或不伴抑制物的血友病A/B患者以预防或减少出血事件。游离TFPI（即未与marstacimab或内源性结合蛋白结合的TFPI）被认为是最直接的靶点占据与调节指标，可用于药代动力学/药效动力学（pharmacokinetic/pharmacodynamic, PK/PD）建模和剂量选择。然而，在高浓度抗体药物存在下定量游离靶点具有很大挑战：样品稀释、捕获试剂、孵育条件等均可能使药物-靶点复合物解离，导致游离靶点高估；内源性结合蛋白以及TFPI的多种亚型进一步增加了测定复杂性。因此，研究人员尝试开发一种定量人血浆中游离TFPI的LC-MSMS方法，以支持marstacimab药物开发项目。

二、研究总体结论
研究人员系统评估了三种蛋白质富集策略与LC-MSMS联用的游离TFPI检测方法。SPR显示marstacimab结合TFPI的平衡解离常数（equilibrium dissociation constant, K_D）为3.7 nM，而竞争性抗体克隆为皮摩尔级亲和力。所有检测方法均出现TFPI过度回收，提示样品处理破坏了marstacimab:TFPI结合平衡。因此，使用现有试剂无法准确测定marstacimab治疗后人血浆中的游离TFPI；该结果表明，采用PK/PD建模等替代策略评价靶点结合是更实际的选择。

三、主要技术方法
研究使用BioIVT公司的人混合柠檬酸钠血浆（8–10名个体混合性别池）及经二次耗竭后TFPI低于0.5 ng/mL的TFPI耗竭血浆，以TFPI K1结构域中保守肽FFFNIFTR（FFFN）作为替代肽，并以稳定同位素标记肽为内标，建立LC-MSMS定量方法。三种蛋白富集策略包括：（1）FXa结合伴侣捕获（生物素化FXa或环氧磁珠固定FXa）；（2）竞争性抗体捕获（与marstacimab同表位的抗TFPI单克隆抗体克隆#69/#89）；（3）药物耗竭（Protein A/G磁珠去除内源性IgG及游离和结合型marstacimab）。SPR用于测定结合亲和力；质量作用模型用于预测不同marstacimab浓度下理论游离TFPI回收率。

四、研究结果
结合亲和力与理论预测：SPR测得marstacimab与TFPI的K_D=3.7 nM，克隆#69/#89的K_D为皮摩尔级。基于2:1结合化学计量和平均TFPI浓度2.5 nM的模型预测，游离TFPI应随marstacimab浓度升高而显著降低。

策略1（FXa结合伴侣捕获）：在3.3、33、333 nM marstacimab下，生物素化FXa捕获测得的游离TFPI回收率分别为100.7%、97.3%、78.9%，较理论预测高2、18、142倍；环氧磁珠固定FXa时分别为98.6%、79.7%、34.3%，高2、15、62倍。降低FXa用量导致回收率低且不稳定，FXa偶联后不稳定，最终放弃该方法。

策略2（竞争性抗体捕获）：克隆#69在相同marstacimab浓度下测得游离TFPI回收率为99%、61%、35%，较预测高2、11、67倍；克隆#89为86%、58%、32%，高2、11、63倍。即使使用低稀释度和30分钟短捕获时间，仍发生marstacimab:TFPI复合物解离。

策略3（药物耗竭）：Protein A/G磁珠去除内源性IgG和marstacimab后，表观游离TFPI回收率为理论预测的183–3050倍；不同磁珠体积和单次/重复免疫沉淀均无法改善。

样品稀释效应：血浆稀释至1:10时，以多克隆抗TFPI抗体BAF-2974、FXa、marstacimab为捕获试剂，TFPI回收率分别增加2.3、2.1、2.5倍，说明稀释本身促进TFPI从内源性结合复合物中解离。

五、讨论与结论
讨论指出，三种富集策略的过度回收不随捕获试剂亲和力变化而改变，提示主要机制是样品稀释和处理破坏了TFPI与其内源性结合蛋白及marstacimab的平衡；高亲和力竞争试剂会加剧解离，磁珠固定也不足以避免；孵育时间变化不能解决这一问题。研究局限性为探索性、重复有限，但三种正交策略的定性结果一致。

研究结论翻译：总之，使用所评估的免疫亲和LC-MSMS捕获方法及试剂，无法可靠地直接测定经marstacimab处理的人血浆样本中的游离（未结合）TFPI。数据显示，游离TFPI高估由多个因素驱动，包括稀释引起的marstacimab:TFPI结合平衡扰动；1:10稀释使三种捕获试剂下观察到的游离TFPI回收率增加2.1–2.5倍。捕获试剂亲和力是进一步放大该效应的因素，孵育条件也引入额外偏差。在低亲和力药物-靶点相互作用中，样品稀释导致的固有扰动是主要限制。因此，整合总TFPI、marstacimab浓度和相关PD生物标志物的PK/PD建模策略，是临床环境中评估药物-靶点结合的更实用且稳健的方法。