鄱阳湖周边稻田越冬四种鹤类肠道微生物的宿主关联分化

《Ecology and Evolution》：Host-Associated Differentiation of Gut Microbiota Among Four Crane Species Wintering in Rice Paddies Around Poyang Lake

　　

摘要专业翻译 不同鸟类物种在利用相同的大范围觅食栖息地时，是否仍保留各自独特的肠道微生物群落，这一问题尚不清楚。研究人员采用16S rRNA基因扩增子测序技术，对中国鄱阳湖周边稻田越冬的四种鹤类共51份粪便样本的肠道微生物群进行了表征。所采样物种包括白鹤（Leucogeranus leucogeranus）、白枕鹤（Grus vipio）、灰鹤（G. grus）和白头鹤（G. monacha）。物种分类组成及全部四项α多样性指数在不同宿主物种间均存在差异，而β多样性则表现出部分宿主关联的分离（PERMANOVA，R2 = 0.19，p = 0.0033）。在124个核心ASV中，仅有8个为四种鹤类共有，而85个为物种特异性。灰鹤与白头鹤在宿主系统发育树和微生物树中均聚类在一起，提供了有限的拓扑一致性。然而，总体上宿主系统发育距离与微生物群落差异之间并无显著关联（Mantel检验，r = ?0.293，p = 0.667）。预测功能谱保留了大量的共有组分，77.8%的KEGG直系同源基因（KO）在四种鹤类中均有检出，尽管整体功能组成在宿主间存在显著差异。潜在病原相关类群的相对丰度总体较低，且在物种间存在一定变异。这些研究结果表明，共享稻田栖息地并不能确保微生物群落的趋同，并强调了在检验野生鸟类系统共生时需要整合食性数据。

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一、研究背景与科学问题

野生鸟类肠道中栖息着多样化的微生物群落，这些微生物在营养获取、能量代谢、维生素合成、免疫调节及病原防御等方面发挥重要作用，进而影响宿主的健康与适合度。鸟类肠道微生物群落的多样性和组成受内在因素与外在因素共同塑造：内在因素包括宿主系统发育、遗传背景、肠道形态结构和免疫功能；外在因素则包括食性、栖息地、气候和行为等。厘清这些驱动因素的相对贡献，一直是微生物生态学领域的核心挑战。已有研究表明，宿主相关模式乃至系统发育信号在肠道微生物群落中有所体现，这种宿主系统发育与微生物群落关系之间的对应被称为系统共生（phylosymbiosis），其可能部分源于宿主过滤作用。与此同时，肠道微生物群落也能对食性和环境变化作出快速响应。

在鄱阳湖地区，受长江上游水库调度和气候变率影响，水文情势近年发生显著变化。生长季的持续淹水减少了沉水植物，从而限制了越冬水鸟的天然食物资源。因此，包括鹤类和雁类在内的许多水鸟越来越多地利用农田栖息地，尤其是稻田，作为替代觅食地。与天然湿地相比，稻田在食物资源、环境微生物群落和人为干扰等方面存在差异，这些因素均可能影响鸟类肠道微生物群落。由于栖息地利用可影响鸟类粪便微生物群落，稻田为跨物种比较提供了一个共同的大范围栖息地类型。然而，利用稻田并不意味着食性、采样点条件或微生物暴露完全相同，宿主相关因素可能在此共同栖息地类型内继续施加强烈的过滤效应。

四种在鄱阳湖越冬的鹤类为回答上述问题提供了有价值的比较系统。分子系统发育将白鹤置于其余鹤亚科的外侧，白枕鹤属于Antigone物种组，而灰鹤和白头鹤属于Americana物种组。然而，这四种鹤在鄱阳湖内的食性组成、食性宽度和资源重叠方面存在差异。在标准化圈养条件下，全部15种鹤均拥有物种特异性的肠道微生物群落，但仅检测到较弱的系统共生证据。此前虽有研究分别表征了白头鹤的粪便微生物群，或比较了白枕鹤与丹顶鹤的肠道微生物群落，以及记录了白鹤食性变化和灰鹤极端干旱相关的微生物变化，但基于野外同时考虑多种鹤类、宿主系统发育和共同大范围栖息地类型的比较研究仍然有限。

基于此，研究人员利用16S rRNA基因扩增子测序，比较了鄱阳湖周边稻田越冬的四种鹤类的粪便微生物群落。核心科学问题是：在同一大范围栖息地类型内，粪便微生物群落是否因宿主物种不同而存在差异，以及种间微生物差异是否与宿主系统发育距离相对应。研究人员预测，宿主特异性过滤将产生物种间不同的分类群落；若微生物差异随宿主系统发育距离增加而增大，且亲缘关系较近的灰鹤与白头鹤表现出更大相似性，则支持系统共生模式；反之，稻田觅食的强烈同质化影响将促进更大的分类和功能趋同。

二、主要关键技术方法

研究人员在2020年11月至12月期间，于鄱阳湖周边不同稻田采集了四种鹤类共51份新鲜粪便样本，其中白鹤（LL）12份、白枕鹤（GV）15份、灰鹤（GG）12份、白头鹤（GM）12份。样本采集采用非侵入方式，通过直接观察鹤类排便行为确认物种身份，采样点间距至少5米以避免重复采样。DNA提取后扩增16S rRNA基因V3–V4区，在Illumina平台进行双端测序。生物信息学分析采用DADA2流程获得扩增子序列变体（ASV），以SILVA v138数据库进行物种注释，构建系统发育树。统计方法包括Kruskal–Wallis检验、PERMANOVA、PERMDISP、Mantel检验、LEfSe差异分析及PICRUSt2功能预测。宿主系统发育树基于线粒体COI序列构建。

三、研究结果

3.1 肠道微生物群落组成、核心菌群和指示ASV在鹤类间存在差异

四种鹤类的肠道细菌群落以厚壁菌门（Firmicutes，49.15% ± 16.06%）和变形菌门（Proteobacteria，26.36% ± 7.93%）为主，其次为拟杆菌门（Bacteroidota，9.37% ± 6.69%）、弯曲杆菌门（Campylobacterota，6.62% ± 3.16%）、梭杆菌门（Fusobacteriota，4.90% ± 3.84%）和放线菌门（Actinobacteriota，3.28% ± 3.72%）。六个优势菌门的相对丰度在宿主物种间均存在显著差异。属水平上，白枕鹤的乳杆菌属（Ligilactobacillus）相对丰度较高（35.85%），白鹤的梭菌属（Clostridium sensu stricto 1）相对丰度较高（9.56%），灰鹤的弯曲杆菌属（Campylobacter，8.68%）和梭杆菌属（Fusobacterium，8.22%）相对丰度较高，白头鹤的副梭菌属（Paraclostridium，6.83%）和螺杆菌属（Helicobacter，4.07%）相对丰度较高。核心菌群分析显示，四种鹤类核心ASV集合的并集共含124个ASV，其中仅8个（6.5%）为四物种共有，85个（68.5%）为物种特异性。白头鹤拥有最多的物种特异性核心ASV（64个）。指示分析鉴定出606个显著指示ASV，其中396个（65.3%）与单一宿主物种相关，白头鹤的物种特异性指示ASV数量最多（304个）。

3.2 肠道微生物多样性在宿主间存在差异，系统发育一致性有限

α多样性四项指标（观测丰富度、ACE、Shannon和Simpson指数）在四种鹤类间均存在显著差异。白头鹤在所有四项指标上均显著高于其他三种鹤类，而白鹤、灰鹤和白枕鹤之间的大多数成对差异不显著。β多样性分析中，基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示样本按宿主物种部分分离，PERMANOVA确认物种间群落组成差异显著（R² = 0.19，p = 0.0033），PERMDISP未检测到显著的离散度异质性。灰鹤和白头鹤在宿主系统发育树中形成姐妹群，在UPGMA和NJ微生物树中也聚类在一起，提供了部分拓扑一致性。但Mantel检验未检测到宿主系统发育距离与微生物群落差异之间的显著关联（r = ?0.293，p = 0.667），因此四种鹤类的比较未为整体系统共生模式提供统计支持。

3.3 预测肠道微生物功能的宿主关联差异

PICRUSt2功能预测显示，基于KEGG直系同源基因（KO）的功能谱在宿主物种间部分分离，PERMANOVA确认物种间预测功能组成差异显著（R² = 0.22，p < 0.001）。六组成对比较中五组差异显著，仅白鹤与灰鹤之间无显著差异。尽管存在差异，5844个预测KO中有4546个（77.8%）为四种鹤类共有。白头鹤拥有最大规模的物种特异性预测KO集合（651个）。KEGG二级功能类别以碳水化合物代谢、膜转运和氨基酸代谢为主，整体预测功能谱含有大量共有组分。

3.4 潜在病原相关类群的发生与相对丰度

共检测到18个潜在病原相关属和3个种。每宿主检出的属数量范围为白鹤10个至白头鹤13个。Clostridium、Prevotella、Streptococcus和Mycobacterium四个属在超过半数样本中出现，其中Clostridium的平均相对丰度最高，在四种鹤类中均超过2%。物种水平上，Mucispirillum schaedleri和Prevotella melaninogenica在四种鹤类中均有检出，而Rothia dentocariosa仅在白头鹤中检出。注释属的相对丰度合计以灰鹤最高（12.55%），其次为白鹤（11.24%）、白头鹤（7.81%）和白枕鹤（7.21%）。

四、讨论与结论

本研究表明，共享稻田这一大范围栖息地类型并未导致四种鹤类肠道微生物群落完全趋同。群落组成、α和β多样性、核心菌群、指示ASV及预测功能谱均表现出物种关联的分化。然而，由于每种鹤类在各自不同位点采样，宿主物种效应无法与局地位点效应区分。灰鹤与白头鹤在宿主和微生物树中的聚类仅提供了有限的描述性拓扑一致性，四种物种的比较不足以在统计上支持整体系统共生模式。共享稻田不应等同于食性相同，此前的DNA宏条形码研究已显示这四种鹤类在鄱阳湖存在显著的种间和年际食性差异，而食性可强烈塑造肠道微生物群落的组成和组装。预测功能谱中大量共有组分的存在表明肠道微生物群落存在功能冗余，但功能组成在宿主间的显著差异也说明分类更替并非完全功能中性。潜在病原相关类群总体丰度较低，但属级分类无法区分致病与非致病菌株，粪便检出也不代表感染或疾病，因此这些数据仅作为未来监测的描述性基线。研究结论为：尽管四种鹤类均以稻田作为大范围觅食栖息地，其肠道微生物群落并未完全趋同，但宿主物种差异无法与局地环境变异分离。未来研究应结合同一位点的重复多物种采样、食性宏条形码、环境因子测定、宏基因组学和纵向采样设计，以更好地解析宿主身份、食性、局地环境和时间变异对鸟类肠道微生物群落的相对贡献。