《Letters in Drug Design & Discovery》：Apolipoprotein C1 and C-X-C motif chemokine receptor 4 as myeloid-associated candidate genes in glioblastoma: An integrative transcriptomic analysis
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背景：肿瘤相关髓系细胞，包括常驻小胶质细胞和募集的巨噬细胞，是胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤微环境的主要组成部分。本研究旨在通过整合单细胞和批量转录组分析，识别与GBM相关的髓系相关候选基因。
方法：研究人员使用GSE221534中六个GBM样本的单细胞RNA测
背景：肿瘤相关髓系细胞，包括常驻小胶质细胞和募集的巨噬细胞，是胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤微环境的主要组成部分。本研究旨在通过整合单细胞和批量转录组分析，识别与GBM相关的髓系相关候选基因。
方法：研究人员使用GSE221534中六个GBM样本的单细胞RNA测序数据进行初步细胞状态注释、基于CopyKAT的拷贝数推断、CellChat分析和高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）。将髓系相关模块基因与泛胶质瘤GSE4290微阵列队列（包含157个胶质瘤样本和23个癫痫来源的非肿瘤脑样本）中识别出的差异表达基因取交集。研究人员采用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归及支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）进行特征选择。随后进行了CIBERSORT、ESTIMATE和探索性DSigDB药物特征分析。
结果：研究人员识别出11个推定的细胞群体或状态以及5个hdWGCNA模块。CopyKAT显示在初步注释的胶质样群体内存在混合拷贝数状态。模块M2和M3在注释的小胶质细胞/髓系簇中显示相对较高的活性。在泛胶质瘤GSE4290比较中，识别出2427个差异表达基因，包括953个上调基因和1474个下调基因，其中17个与M2/M3基因重叠。LASSO和SVM-RFE的十折交叉验证产生了8个共享候选基因：MALAT1、APOE、CEBPD、APOC1、NR4A2、CXCR4、C1QA和FCGRT。在整个GSE4290队列中，APOC1和CXCR4与CIBERSORT推断的M2巨噬细胞比例呈正相关（Spearman ρ分别为0.621和0.600；校正后P分别为7.60 × 10?1?和2.36 × 10?1?，以校正后P < 0.05作为研究范围内的显著性阈值）。吡格列酮是9个显著DSigDB条目之一（校正后P = 0.00988），并与APOC1和CXCR4重叠。
讨论：该分析提名APOC1和CXCR4为髓系相关候选基因，而非细胞类型特异性或经临床验证的生物标志物。泛胶质瘤批量分析、免疫去卷积、CellChat和药物特征分析结果均为探索性的，需要在独立的GBM队列中进行验证。
结论：APOC1和CXCR4是与GBM相关髓系程序相关的候选基因。它们的细胞定位、预后意义和治疗意义需要独立且实验性的验证。
论文解读：整合转录组学解析胶质母细胞瘤髓系相关候选基因
一、研究背景与问题
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，以广泛的分子、细胞和空间异质性为特征。尽管目前的标准治疗方案通常包括最大安全手术切除联合放疗和替莫唑胺化疗，但复发几乎不可避免，长期生存率仍然很低。治疗失败不仅源于肿瘤细胞内在的耐药性，还归因于恶性细胞与周围神经、血管、基质和免疫组分之间的相互作用。近年来，癌症神经科学领域揭示了GBM与大脑细胞结构之间的复杂功能联系。小胶质细胞是起源于卵黄囊的组织常驻巨噬细胞，在胚胎发生早期定植于中枢神经系统，并对组织损伤和肿瘤衍生信号产生多样化的激活状态。在GBM中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）的概念涵盖了常驻小胶质细胞和募集的骨髓来源单核细胞/巨噬细胞，这些细胞构成了肿瘤微环境的重要组成部分，但比例变化较大，可能促进肿瘤生长、侵袭、血管生成和免疫抑制。然而，由于小胶质细胞和浸润巨噬细胞的转录状态存在重叠，基于标志物进行区分仍然困难。批量转录组分析是对恶性和非恶性细胞群体信号的混合平均，无法确定细胞类型特异性，而单细胞RNA测序则能提供细胞分辨率的表达信息。为此，研究人员提出通过整合单细胞共表达模块与批量差异表达分析，在保留疾病层面相关性的同时识别与髓系程序相关的候选基因，并明确将其描述为“髓系相关”而非细胞类型特异性，除非直接证明了特定细胞群体的限制性表达。已有研究表明APOC1与GBM肿瘤发生及表达APOC1的小胶质细胞状态相关，CXCR4则与GBM的前神经-间质转化及不良预后有关。但这两个基因均不局限于小胶质细胞，可能反映更广泛的肿瘤或免疫状态。
二、研究内容与结论
研究人员将GSE221534单细胞数据与GSE4290微阵列数据相结合，运用hdWGCNA及互补的特征选择方法，以提名髓系相关候选基因。这一基于细胞分辨率的共表达策略不同于仅基于批量转录组平均值的筛查，同时将下游药物特征分析视为探索性的。最终，研究人员确定了八个髓系相关候选基因，其中APOC1和CXCR4由于与显著的吡格列酮相关DSigDB条目重叠而被重点关注。结论指出，APOC1和CXCR4是GBM相关髓系程序相关的候选基因，但其细胞定位、预后相关性和治疗意义需要独立且实验性的验证，在临床解释之前需要独立的GBM队列、空间或蛋白质层面的验证以及机制实验。
三、关键技术方法
研究人员使用了两个公共数据集：包含六个无癫痫患者肿瘤样本的GBM单细胞数据集GSE221534，以及包含157个胶质瘤样本（26个星形细胞瘤、50个少突胶质瘤、81个胶质母细胞瘤）和23个癫痫来源非肿瘤脑样本的GSE4290微阵列数据集，两者均来源于基因表达汇编（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库。主要技术方法包括：使用Seurat包对单细胞数据进行处理、聚类和注释，结合Harmony校正样本间批次效应；运用CopyKAT进行拷贝数推断；通过CellChat推断细胞间配体-受体通讯；针对注释的小胶质细胞/髓系簇使用hdWGCNA构建共表达网络，识别髓系相关基因模块；利用limma包进行差异表达分析；采用LASSO回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）进行特征选择；通过CIBERSORT和ESTIMATE评估免疫细胞浸润和微环境评分；使用enrichR查询DSigDB进行探索性药物特征分析。
四、研究结果
1. GBM中的单细胞图谱、拷贝数推断和细胞间通讯：对GSE221534的分析识别出11个推定的细胞群体或转录状态，包括EEF2+少突胶质细胞、小胶质细胞/髓系、PTPRZ1+星形胶质细胞样、MT2A+星形胶质细胞样、JUNB+星形胶质细胞样、EGFR+少突胶质细胞样、间质、成熟少突胶质细胞、免疫少突胶质细胞样、血管内皮和红细胞状态。由于HLA-DRA、TYROBP和C1QB是泛髓系标志物，且一些胶质样标签包含肿瘤相关基因，这些注释被视为初步的。功能富集分析显示，在最适性表达的基因中，小胶质细胞/髓系簇富集了免疫相关过程（图1D）。CopyKAT在PTPRZ1+星形胶质细胞样、EGFR+少突胶质细胞样和免疫少突胶质细胞样群体中显示混合的非整倍体、二倍体和非定义状态，没有稳定统一的恶性拷贝数模式，因此这些群体被保留为初步的转录标签而非明确分类为正常或恶性。CellChat预测了几个注释细胞状态到小胶质细胞/髓系簇的APP-CD74相关配体-受体信号传入，其中PTPRZ1+星形胶质细胞样、EGFR+少突胶质细胞样和成熟少突胶质细胞状态的通讯概率相对较强，APP被指定为发送者表达的配体，CD74被指定为靶标簇表达受体，此结果仅是基于共表达通讯的假说，不证明功能性细胞间互作。
2. 髓系相关基因模块的识别：共2610个在至少5%细胞中表达的基因纳入hdWGCNA分析，根据无尺度拓扑和连接性诊断选择软阈值β=6，生成带符号共表达网络和树状图，计算特征基因连接度（kME），识别出5个非灰色模块（M1至M5）。模块M2和M3在目标小胶质细胞/髓系簇中显示出相对较高的样本校正特征基因值和较大比例的高活性细胞，因此被保留，其枢纽基因网络包含每模块10个主要和15个次要枢纽基因。
3. 髓系相关候选基因的鉴定：在157个胶质瘤与23个癫痫来源非肿瘤样本的差异表达分析中，识别出2427个差异表达基因（953个上调，1474个下调）。与M2/M3基因求交集后获得17个共享基因。对这17个共享基因进行LASSO回归和SVM-RFE（均采用十折交叉验证）后，LASSO在λmin=0.0053时保留10个基因，SVM-RFE在10个变量时达到最低交叉验证误差，两者交集包含8个基因：MALAT1、APOE、CEBPD、APOC1、NR4A2、CXCR4、C1QA和FCGRT，作为下游探索性分析的候选基因，而非经过验证的诊断或预后生物标志物。
4. 候选基因与免疫估计的关联：CIBERSORT分析显示，胶质瘤与癫痫来源非肿瘤对照之间存在8个推断免疫细胞亚群比例的差异。在整个GSE4290队列（n=180）中，APOC1和CXCR4均与M2巨噬细胞估计值呈正相关（APOC1：ρ=0.621，调整后P=7.60×10?1?；CXCR4：ρ=0.600，调整后P=2.36×10?1?）。胶质瘤样本的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore均较高。APOC1与StromalScore（ρ=0.485）、ImmuneScore（ρ=0.662）和ESTIMATEScore（ρ=0.612）显著相关；CXCR4与StromalScore（ρ=0.708）、ImmuneScore（ρ=0.786）和ESTIMATEScore（ρ=0.786）显著相关。由于这些相关是在胶质瘤/对照合并队列中计算的，可能部分反映了组间表达差异。
5. 探索性药物特征分析：DSigDB分析返回221个条目，其中9个达到调整后P<0.05的显著性标准。排名靠前的显著条目包括布地奈德、异氟泼酮、氟替卡松、椭圆玫瑰树碱和(+)-白屈菜碱。吡格列酮排名第六（调整后P=0.00988；综合得分=985.82），与APOC1和CXCR4重叠。这些结果仅代表基因集关联，不能解释为直接结合或临床疗效的证据。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，研究人员通过整合单细胞共表达分析与泛胶质瘤微阵列差异表达及两种特征选择方法，确定了8个髓系相关候选基因，其中APOC1和CXCR4因与显著的吡格列酮相关DSigDB条目同时相关而被优先关注。注释的小胶质细胞/髓系簇中富集的基因与免疫过程相关，包括T细胞活化调节和细胞因子产生，这与GBM相关髓系细胞参与炎症信号和免疫抑制的生物学背景一致。CellChat预测的APP-CD74通讯虽然在GBM中已有巨噬细胞吞噬作用的研究报道，但本次分析仅基于配体-受体共表达，不能确定物理性细胞间互作、因果调控或功能后果。CopyKAT的混合拷贝数状态支持使用初步的胶质样标签，但不排除恶性细胞混杂。APOC1与GBM肿瘤发生及表达APOC1的小胶质细胞状态相关，CXCR4则与免疫、血管、神经祖细胞和恶性细胞区室均有表达并关联前神经-间质转化。两个基因与M2巨噬细胞估计值和ESTIMATE评分的正相关可能反映免疫细胞丰度和胶质瘤-对照差异，而非直接调控。吡格列酮作为PPARγ激动剂，现有证据涉及其对TOMM40-APOE-C1基因簇的间接PPARγ介导调控，因此该DSigDB结果仅为假说生成性质，不将APOC1或CXCR4认定为直接药物靶点。研究局限性包括：单细胞分析仅依赖来自单一数据集的六个样本，无法验证细胞状态可重复性；基于标志物的注释无法明确区分常驻小胶质细胞和募集的巨噬细胞，且CopyKAT显示胶质样群体混合拷贝数状态；GSE4290作为泛胶质瘤历史微阵列队列而非GBM特异性独立验证队列；免疫相关分析在全队列上进行可能受组间差异影响，LM22矩阵并非脑或GBM特异性；LASSO和SVM-RFE仅用于特征选择，缺乏独立验证和生存分析；细胞定位、蛋白表达和功能影响未经实验验证，DSigDB关联也未证明直接药物-靶点结合。
研究结论为：对GBM单细胞数据和泛胶质瘤微阵列数据的整合分析提名了8个髓系相关候选基因，其中APOC1和CXCR4在免疫相关性分析和探索性药物特征分析中得到了进一步研究。这些发现为GBM相关髓系生物学提供了可检验的假说，但并未建立细胞类型特异性、预后效用、直接药物-靶点结合或治疗功效。在临床解释之前，需要独立的GBM队列、空间或蛋白质层面验证以及机制实验。
