《Letters in Drug Design & Discovery》：An eight-gene riskscore model and computational evaluation of the PDGFRB-imatinib interaction in HBV-positive hepatocellular carcinoma
编辑推荐：
## 中文摘要翻译
**背景**：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染可引起持续性肝损伤、纤维化、肝硬化和肝癌发生。由于不同病因的肝细胞癌（HCC）具有不同的分子和免疫学特征，基于混合病因人群构建的模型可能无法充分代表HBV相关HCC。本研究旨在开发一个针对HBV
## 中文摘要翻译
**背景**：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染可引起持续性肝损伤、纤维化、肝硬化和肝癌发生。由于不同病因的肝细胞癌（HCC）具有不同的分子和免疫学特征，基于混合病因人群构建的模型可能无法充分代表HBV相关HCC。本研究旨在开发一个针对HBV阳性HCC的预后风险评分（RiskScore）模型，并通过计算手段筛选候选化合物。
**方法**：分析了来自TCGA-LIHC（n=60；训练集）、ICGC-LIRI-JP（n=53；验证集）和GSE141198的bulk RNA-seq数据，以及GSE149614的单细胞RNA-seq数据。采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析以及单因素和逐步多因素Cox回归构建模型。使用最大化选择秩统计确定的TCGA衍生截断值0.612直接应用于ICGC队列。采用1000次bootstrap重抽样评估模型乐观度，并进行临床变量校正的Cox分析。利用ssGSEA、MCP-counter、ESTIMATE、CIBERSORT-ABS和xCell评估免疫浸润情况。评估患者水平的细胞组成和RiskScore_sc。使用比较毒物基因组学数据库（CTD）筛选药物–基因相互作用，随后进行smina分子对接和GROMACS分子动力学模拟。
**结果**：该模型包含GATA5、LAPTM4B、LTBP4、MYO1E、NKAPL、TNXB、U2AF1和UNG八个基因。在TCGA队列中，1年、3年和5年的AUC分别为0.91（95%CI，0.75–1.00）、0.94（0.84–1.00）和0.88（0.71–0.98）；bootstrap校正后的Harrell C指数为0.832（0.738–0.916）。ICGC队列相应的AUC分别为0.75（0.17–1.00）、0.85（0.59–1.00）和0.75（0.32–1.00）。固定截断值可在ICGC队列中有效分层总生存期（log-rank P=0.006）。在57例TCGA完整病例中，经年龄、性别、AJCC分期和肿瘤分级校正后，RiskScore仍与生存期显著相关（P<0.001）。MCP-counter和ssGSEA识别的免疫差异未被CIBERSORT-ABS和xCell在多重检验校正后一致重现；高风险组的肿瘤纯度较高（P=0.0046）。患者水平分析显示肿瘤T/NK细胞比例较低（FDR=0.00145），而肝细胞比例和细胞类型特异性RiskScore_sc差异无统计学意义。PDGFRB主要在成纤维细胞中表达，PDGFRB–伊马替尼的最佳结合构象得分为?12.4 kcal/mol。
**结论**：八基因RiskScore与HBV阳性HCC的预后及探索性免疫和基质特征相关。伊马替尼被计算预测为可与PDGFRB相互作用的候选化合物，但其生物学活性和治疗效果仍需实验验证。
## 论文解读
### 一、研究背景与问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的原发性恶性肿瘤之一，约占原发性肝癌的75%–85%，位居全球癌症相关死亡原因的第三位。尽管手术切除、肝移植和局部消融等手段可提供治愈机会，但内在和获得性耐药以及术后频繁复发严重限制了其疗效，超过一半的患者在切除术后五年内出现复发。因此，深入理解HCC进展机制并发现稳健的预后生物标志物，对于指导临床干预和改善长期生存具有重要意义。
HCC在病因学上与黄曲霉毒素暴露、慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、酗酒和代谢紊乱密切相关。2019年全球约有2.96亿人慢性感染HBV，相关死亡达82万例，疾病负担持续严峻。尽管疫苗接种和抗病毒治疗降低了病毒驱动的HCC发病率，但缺乏根治性HBV疗法使现有携带者面临持续风险。重要的是，HBV感染引发的HCC在病毒整合模式、慢性炎症、纤维化重塑和免疫微环境等方面与HCV相关、酒精相关及代谢功能障碍相关HCC存在显著差异。将不同病因的肿瘤合并分析可能掩盖HBV相关的分子信号，并在预后建模中引入生物学异质性。因此，研究人员将训练和验证队列限制为HBV阳性HCC，以评估病因学上更均质的人群。
目前虽然已有大量转录组预后特征被报道，但多数源自混合病因队列，在HBV阳性人群中尚未得到充分验证。此外，现有预后研究很少整合HBV相关纤维化重塑、肿瘤免疫组成和潜在可靶向的基质通路之间的关系。PDGF/PDGFR信号轴可驱动肝星状细胞活化、纤维化重塑、细胞增殖和血管生成，并已涉及从肝纤维化到HCC的进展过程，这为研究PDGFRB相关基质信号和计算筛选靶向该通路的化合物提供了生物学依据。
### 二、研究概述与技术方法
该研究整合了bulk RNA-seq和single-cell RNA-seq数据以构建HBV阳性HCC的八基因预后RiskScore模型，并刻画风险相关的免疫和通路特征。数据来源包括TCGA-LIHC队列（60例HBV阳性样本，训练集）、ICGC-LIRI-JP队列（53例HBV阳性样本，验证集）、GEO数据库GSE141198数据集（30例HBV阳性HCC和19例NBNC-HCC作为病因对照），以及GSE149614单细胞数据集（3例正常样本和5例HBV阳性肿瘤样本，共29,326个细胞）。研究主要采用以下技术方法：加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定ESTIMATE评分相关基因模块；edgeR差异表达分析筛选HBV阳性与NBNC-HCC之间的差异表达基因；单因素及逐步多因素Cox回归构建风险评分模型；多种算法（ssGSEA、MCP-counter、ESTIMATE、CIBERSORT-ABS、xCell）评估免疫浸润；KEGG通路富集分析；Seurat与Harmony流水线进行单细胞数据分析；基于CTD数据库的药物–基因相互作用筛选、smina分子对接及GROMACS分子动力学模拟。
### 三、主要研究结果
**3.1 免疫微环境相关WGCNA模块的鉴定**
在HBV阳性HCC中，研究人员采用ESTIMATE包计算ESTIMATE评分以筛选免疫相关基因，随后通过WGCNA鉴定与ESTIMATE评分相关的基因模块。选择软阈值β=12构建无尺度拓扑网络，经层次聚类和模块合并后共获得5个共表达模块。相关性分析显示棕色模块和黄色模块与ESTIMATE评分关联最强，因此被选入后续分析。
**3.2 RiskScore模型的构建与验证**
将GSE141198中HBV阳性HCC与NBNC-HCC的差异表达基因与棕色及黄色模块基因取交集，获得228个HBV相关免疫微环境候选基因。单因素Cox回归（P<0.01）筛得18个与总生存期相关的基因，其中8个经逐步多因素Cox回归保留用于模型构建，最终公式为：RiskScore = ?0.102926×GATA5 + 0.756817×LAPTM4B ? 1.075553×LTBP4 ? 0.776774×MYO1E ? 0.306074×NKAPL + 1.453890×TNXB ? 0.451252×U2AF1 + 2.052941×UNG。其中GATA5、LTBP4、MYO1E、NKAPL和U2AF1为负系数基因，LAPTM4B、TNXB和UNG为正系数基因。在TCGA训练队列中，1、2、3、4、5年时间依赖性AUC分别为0.91、0.91、0.94、0.90和0.88。高风险组患者总生存期显著较差（P<0.0001）。表观C指数为0.875（95%CI，0.779–0.950），经1000次bootstrap乐观校正后C指数为0.832（95%CI，0.738–0.916）。TCGA衍生截断值0.612直接应用于ICGC队列亦能显著分层总生存期（log-rank P=0.006）。在57例临床资料完整的TCGA病例中，经年龄、性别、AJCC分期和肿瘤分级校正后，标准化RiskScore仍与总生存期显著相关（P<0.001）。与三种已发表预后特征的比较显示，八基因模型在TCGA训练队列中C指数更高。
**3.3 不同风险组的免疫浸润特征**
MCP-counter显示高风险组细胞毒性淋巴细胞和NK细胞评分较低，ssGSEA也识别出多个免疫细胞特征评分降低。然而，经Benjamini-Hochberg多重检验校正后，CIBERSORT-ABS和xCell的敏感性分析未一致重现这些差异。高风险组估计肿瘤纯度较高（P=0.0046），肝细胞表达评分无显著差异（P=0.23）。这表明观察到的免疫差异具有算法依赖性，且可能部分受肿瘤纯度影响。
**3.4 高风险组与低风险组的通路富集**
KEGG富集分析显示，高危组明显富集细胞增殖相关通路（如细胞周期、DNA复制），而低危组主要富集细胞黏附分子和酪氨酸代谢等通路。
**3.5 肝纤维化/肝硬化相关基因与免疫的关联**
在ICGC队列中，仅PDGFA在高风险组表现出显著低表达。TGFB1、PDGFB和PDGFRB与免疫评分呈负相关，其余基因无显著关联。这些结果提示TGFB1、PDGFB、PDGFRB与HCC微环境免疫景观存在关联。
**3.6 HBV阳性HCC的单细胞图谱**
对GSE149614数据集的单细胞聚类和注释鉴定出10个细胞群体。患者水平拟二项回归证实肿瘤中T/NK细胞比例显著降低（P<0.001；FDR=0.00145），而肝细胞比例在患者水平无显著差异（P=0.284；FDR=0.28361）。将八基因模型应用于单细胞数据后，RiskScore_sc在UMAP空间呈异质性分布，但按患者和细胞类型聚合后，经多重检验校正无任何细胞群体表现出显著的正常–肿瘤差异。
**3.7 预后基因和纤维化相关基因的单细胞表达谱**
在肝细胞亚群中，HBV阳性HCC患者的LAPTM4B和UNG表达水平高于NBNC正常组。CTGF主要在肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞中检测到；PDGFRB和PDGFA在成纤维细胞中高表达；SMAD2在多种细胞类型中表达；TGFB1在T/NK细胞、髓系细胞1、髓系细胞2、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞等多种免疫细胞中广泛表达。
**3.8 伊马替尼与PDGFRB的分子对接和动力学模拟**
鉴于PDGFRB在成纤维细胞中高表达，研究人员将其选为分子对接靶点，以PDGFRB激酶结构域（PDB ID：11UE）为受体，将伊马替尼游离碱（PubChem CID 5291）作为配体。smina分子对接预测伊马替尼可通过与LEU606、VAL614、ALA632、LYS634、ILE679、THR681、CYS684、LEU833、ASP844和PHE845等残基的相互作用结合PDGFRB口袋，最低对接得分为?12.4 kcal/mol。随后进行了100 ns分子动力学模拟，蛋白骨架RMSD稳定在约0.28–0.34 nm，配体RMSD约0.15–0.20 nm，回旋半径在约2.00 nm附近窄幅分布，未显示明显结构膨胀。四个高占位蛋白–配体氢键占有率分别为9.55%、7.99%、6.54%和5.69%，表明瞬时而非持续维持的氢键接触。
### 四、讨论总结与结论翻译
**讨论总结**：通过将模型开发和验证限定于HBV阳性HCC，该研究旨在降低病因异质性并刻画这一临床相关亚组的风险相关转录组模式。主要贡献在于将八基因预后评分与免疫浸润估计、通路分析、单细胞定位和探索性PDGFRB-伊马替尼建模整合。这些分析为连接HBV阳性HCC的预后、免疫/基质组成和纤维化信号提供了假说。免疫浸润发现的算法依赖性及肿瘤纯度的影响提示结果需谨慎解读。KEGG富集揭示高风险组以增殖信号为主，低风险组以代谢和细胞黏附通路为主。PDGFRB的单细胞定位支持其与纤维化基质组分的潜在关联。分子对接和动力学模拟仅为PDGFRB-伊马替尼相互作用提供了计算证据。研究局限性包括：训练和验证队列样本量小、事件数有限、回顾性设计、缺乏HBV病毒载量和肝硬化状态数据、免疫浸润结果跨算法不一致、单细胞样本量小、缺乏蛋白质水平验证及体外/体内实验。
**结论翻译**：总体而言，本研究在两个回顾性HBV阳性HCC队列中开发了一个八基因RiskScore，其与生存期以及探索性的、算法依赖的免疫和基质特征相关。通路和单细胞分析为模型相关的增殖、免疫和基质特征提供了额外背景。PDGFRB主要在成纤维细胞中表达，伊马替尼被计算预测为可与PDGFRB相互作用的候选化合物。这些发现属于假说生成性质，在RiskScore或候选化合物考虑临床应用之前，需要进一步的统计学、临床、蛋白质水平和功能学验证。
