《Letters in Drug Design & Discovery》：Ephedrine ameliorates systemic sclerosis-associated vascular injury by facilitating macrophage efferocytosis through MerTK-ERK1/2
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目的：系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）以持续性炎症紊乱、细胞功能受损和血管损伤为特征。本研究旨在阐明麻黄碱是否激活MerTK-ERK1/2信号轴，增强巨噬细胞吞噬功能，从而减轻SSc相关血管损伤。方法：研究人员采用Klf5
目的：系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）以持续性炎症紊乱、细胞功能受损和血管损伤为特征。本研究旨在阐明麻黄碱是否激活MerTK-ERK1/2信号轴，增强巨噬细胞吞噬功能，从而减轻SSc相关血管损伤。方法：研究人员采用Klf5+/-Fli1+/-杂合小鼠建立SSc血管疾病模型，将其分为麻黄碱组、空白对照组和模型组。分别以麻黄碱和纯水干预4周后，通过HE和Masson染色观察小鼠皮肤组织病理变化，应用蛋白质印迹法（Western blotting, WB）检测MerTK、p-MerTK、ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测炎症因子（IL-6、TNF-α）、胞葬作用辅助因子（GAS-6、MFG-E8）及血管功能相关因子（NO、ET-1、Ang II）的水平。同时，研究人员构建内源性间接MerTK敲除（knockout, KO）SSc模型，并分为麻黄碱组、空白对照组、模型组和MerTK KO组，经4周相应干预后，采用WB检测MerTK-ERK1/2信号通路的磷酸化水平。此外，建立MerTK-KO RAW264.7巨噬细胞模型，分为对照组、SSc组、麻黄碱组和MerTK KO组，给药48h后收集样本，利用WB检测细胞中MerTK-ERK1/2信号通路激活情况，通过ELISA定量细胞上清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10）、胞葬辅助因子（Gas6、MFG-E8）及血管功能相关因子（NO、ET-1、Ang II），并采用流式细胞术评估胞葬功能。结果：在SSc血管病变小鼠中，麻黄碱干预显著提高组织巨噬细胞中MerTK和ERK1/2的蛋白磷酸化水平，有效上调胞葬辅助因子GAS-6和MFG-E8的表达，减少促炎细胞因子IL-6和TNF-α的分泌，同时升高血管功能因子NO水平，降低ET-1和Ang II表达，从而恢复血管稳态。在MerTK-KO SSc小鼠中，验证实验显示麻黄碱对MerTK-ERK1/2通路磷酸化无明显调节作用；组织病理学染色同样显示，麻黄碱不能减轻SSc小鼠皮肤炎症浸润、胶原增生或病理损伤。结论：麻黄碱通过调节MerTK-ERK1/2信号通路，增强巨噬细胞胞葬功能，抑制炎症反应，恢复血管稳态，进而改善SSc小鼠血管和皮肤病理损伤，为系统性硬化症血管病变的临床治疗提供科学依据。
系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）是一种罕见的慢性多系统自身免疫病，以细胞外基质过度沉积、微血管功能障碍和免疫失调为主要特征，最终导致进行性器官纤维化和不可逆血管损伤。该病全球发病率约为1/10万，已被列入我国2018年发布的第一批罕见病目录，男女比约1:3～1:5，发病高峰为30～50岁。SSc的病理机制复杂，核心环节包括免疫失调、微血管损伤和异常纤维化，三者相互交织形成恶性循环。既往研究证实，炎症紊乱和巨噬细胞胞葬功能缺陷与SSc血管损伤的发生发展密切相关。巨噬细胞胞葬功能受损可导致凋亡细胞堆积，引发继发性坏死和持续性炎症，进一步损伤血管。然而，目前SSc的治疗仍以扩血管、抗纤维化和免疫抑制为主，缺乏针对胞葬缺陷等上游核心机制的靶向策略。麻黄碱具有抗炎、免疫调节和血管调节等药理作用，但其在SSc血管损伤中的作用，尤其是对巨噬细胞胞葬功能的调控机制尚不明确。MerTK是TAM受体酪氨酸激酶家族成员，是巨噬细胞胞葬功能的关键调控因子，其下游信号涉及ERK1/2通路。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明麻黄碱是否通过激活MerTK-ERK1/2信号轴促进巨噬细胞胞葬作用，从而减轻SSc相关血管损伤。
研究人员选用SPF级C57BL/6空白小鼠和Klf5
+/-Fli1
+/-杂合小鼠（购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（北京）2024-0001）建立SSc血管损伤模型，并采用MerTK选择性抑制剂UNC2250构建内源性间接MerTK敲低模型。体外实验中，研究人员使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7（购自中国科学院上海细胞库）建立SSc样炎症模型，并通过慢病毒shRNA转染构建MerTK敲除（knockout, KO）细胞模型。主要关键技术包括：苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色和Masson染色观察皮肤组织病理改变；蛋白质印迹法（Western blotting, WB）检测MerTK、p-MerTK、ERK1/2和p-ERK1/2的表达及磷酸化水平；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量炎症因子、胞葬辅助因子及血管功能相关因子；免疫荧光染色评估CD31阳性微血管密度；免疫组织化学检测α-SMA和CD68表达；流式细胞术检测巨噬细胞胞葬效率。
研究结果如下：
3.1 体内实验：系统性硬化症血管损伤小鼠
3.1.1 HE和Masson染色观察皮肤病理变化：与对照组相比，SSc模型组小鼠皮肤组织可见明显炎症细胞浸润、胶原沉积增多和真皮增厚；麻黄碱干预后，炎症浸润和胶原增生显著减轻，皮肤病理损伤得到改善。
3.1.2 通路因子：WB结果显示，与对照组相比，SSc模型组ERK1/2、p-ERK1/2、MerTK和p-MerTK蛋白表达水平显著降低；麻黄碱干预后，上述关键蛋白及其磷酸化水平明显回升，表明麻黄碱可激活MerTK-ERK1/2信号通路。
3.1.3 胞葬因子：ELISA检测显示，SSc模型组GAS-6和MFG-E8水平较对照组显著降低，麻黄碱干预后两者水平明显升高，提示麻黄碱可上调胞葬辅助因子。
3.1.4 炎症因子：SSc模型组IL-6和TNF-α水平显著升高，麻黄碱干预后明显下降，表明麻黄碱可抑制促炎细胞因子分泌。
3.1.5 血管损伤相关因子：SSc模型组NO水平降低，ET-1和Ang II水平升高；麻黄碱干预后NO水平回升，ET-1和Ang II水平下降，提示麻黄碱有助于恢复血管稳态。
3.2 体内实验：内源性间接MerTK敲低模型
3.2.1 MerTK-ERK1/2磷酸化表达：Western blot结果显示，MerTK KO组出现与SSc模型组类似的通路抑制，麻黄碱干预不能恢复MerTK KO小鼠中p-ERK1/2、MerTK和p-MerTK的表达，证实麻黄碱对MerTK/ERK通路的激活依赖于MerTK。
3.2.2 炎症因子、吞噬辅助因子及血管功能相关因子：ELISA结果证实，在MerTK KO小鼠中，麻黄碱无法逆转SSc引起的促炎因子升高、胞葬辅助因子降低以及血管功能相关因子异常，说明麻黄碱的抗炎和血管保护作用依赖MerTK信号。
3.2.3 血管平滑肌细胞表型和巨噬细胞浸润：免疫组化染色显示，SSc模型组α-SMA分布紊乱且表达降低，CD68
+巨噬细胞浸润显著增加；麻黄碱干预可部分恢复α-SMA表达并减少CD68表达，而MerTK KO后这些效应消失，表明麻黄碱以MerTK依赖方式调节血管平滑肌细胞表型和巨噬细胞浸润。
3.2.4 微血管密度：CD31免疫荧光染色显示，SSc模型组CD31阳性微血管密度显著低于对照组；麻黄碱干预后微血管密度明显增加；但在MerTK KO小鼠中，麻黄碱不能恢复微血管密度，证实麻黄碱介导的血管修复依赖于MerTK表达。
3.2.5 巨噬细胞浸润和纤维化抑制：免疫组化定量分析显示，SSc组α-SMA和CD68阳性面积及积分光密度（integrated optical density, IOD）显著高于对照组；麻黄碱干预显著降低二者表达；而MerTK KO后麻黄碱的抑制作用消失，表明麻黄碱的抗纤维化和抑制巨噬细胞浸润作用均由MerTK介导。
3.3 体外救援实验：抑制剂阻断/救援实验
3.3.1 麻黄碱激活RAW264.7巨噬细胞MerTK-ERK1/2信号轴：WB结果证实，SSc组（BLM+TGF-β1刺激）MerTK、p-MerTK和p-ERK1/2表达显著降低，总ERK1/2不变；麻黄碱干预（100μM，48h）显著上调MerTK和ERK1/2磷酸化水平；而在MerTK KO组，ERK1/2磷酸化水平无显著恢复，表明麻黄碱对ERK1/2磷酸化的上调严格依赖于MerTK。
3.3.2 调节炎症因子、胞葬辅助因子及血管功能相关因子：ELISA结果显示，麻黄碱干预可显著降低IL-6、TNF-α、IL-1β水平，升高IL-10、Gas6、MFG-E8和NO水平，并降低ET-1和Ang II水平；但在MerTK KO组，麻黄碱不能逆转上述指标变化，证实其在体外的调节作用同样依赖MerTK信号。
3.3.3 增强巨噬细胞胞葬功能：流式细胞术分析显示，SSc组巨噬细胞胞葬效率显著低于对照组；麻黄碱干预后胞葬效率明显提升；MerTK KO组胞葬效率仍处于低水平，无法被麻黄碱救援，表明麻黄碱在体外以MerTK依赖方式促进巨噬细胞胞葬功能。
讨论部分指出，SSc的血管损伤是疾病起始和核心病理环节，而既往治疗多靶向下游炎症和纤维化事件，未能干预上游启动机制。本研究证明麻黄碱可特异性激活巨噬细胞MerTK-ERK1/2信号轴，上调Gas6和MFG-E8表达，恢复胞葬功能，从而清除凋亡细胞、抑制炎症级联反应，并重建血管稳态。该发现突破了传统抗炎抗纤维化的单一视角，为SSc血管病变提供了“中药单体-MerTK-ERK1/2信号轴-免疫胞葬修复-血管稳态保护”的新模型。同时，研究也指出局限性：未建立多梯度剂量组，尚未明确麻黄碱与MerTK/ERK1/2的直接结合靶点，且缺乏临床验证。未来研究需通过分子对接、多剂量药效学、临床样本检测及多中心试验进一步推进转化。
研究结论：麻黄碱可通过调节MerTK-ERK1/2信号通路，增强巨噬细胞胞葬功能，抑制炎症反应，恢复血管稳态，从而改善SSc小鼠血管和皮肤病理损伤，为系统性硬化症血管病变的临床治疗提供科学依据。
