《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Pancreatic Cancer Disrupts Circadian Patterns of Gene Expression in Cardiorespiratory Muscles
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背景：癌症恶病质是一种以肌肉萎缩为特征的消耗性综合征，显著影响胃肠道癌（如胰腺癌）患者的生存期。新近证据表明，癌症恶病质与外周组织（包括运动肌）的昼夜节律紊乱有关。然而，心肺肌——其功能衰退被认为与恶病质患者发病率和死亡率增加有关——中的昼夜节律失调在很大程度
背景：癌症恶病质是一种以肌肉萎缩为特征的消耗性综合征，显著影响胃肠道癌（如胰腺癌）患者的生存期。新近证据表明，癌症恶病质与外周组织（包括运动肌）的昼夜节律紊乱有关。然而，心肺肌——其功能衰退被认为与恶病质患者发病率和死亡率增加有关——中的昼夜节律失调在很大程度上仍未被探索。
方法：在本研究中，研究人员利用原位KPC胰腺癌模型，研究了恶病质期间心肺肌中的昼夜节律基因表达模式。为此，从假手术组（Sham）和KPC小鼠的膈肌和心脏组织中生成了昼夜节律转录组数据，这些组织在接种后第12天开始每4小时采集一次，持续24小时。根据先前的研究，该时间点反映了该模型中恶病质的起始阶段。使用LR_rhythmicity R包鉴定节律性表达基因（REGs）（Pc < 0.01），该包评估转录振荡对24小时正弦波模型的拟合优度（R2）。使用LR_diff R包评估昼夜节律模式的差异，包括振幅、相位和基础表达的变化，显著性水平为p < 0.05。
结果：研究人员发现，在两个组织中约60%的节律性基因丧失了昼夜节律性，并伴有明显的基因网络转变。膈肌中的破坏主要集中在核心时钟组分的基础表达和/或振幅的抑制，以及在静息期依赖性的、调控脂质和氧化代谢程序以及蛋白质稳态的基因网络的破坏，这些变化与炎症网络的上调和获得节律性有关，后者在静息期达到峰值。心脏中的昼夜节律破坏涉及调控心脏功能的基因网络（包括β-肾上腺素能和cAMP信号通路、细胞对胰岛素的反应以及神经发生）失去节律性，同时伴随类似但更有限的炎症网络上调。
结论：这些发现表明，胰腺癌恶病质与心肺肌中广泛的昼夜节律失调相关，这可能同时导致肌肉萎缩和功能衰退。
研究背景与科学问题
癌症恶病质是一种以骨骼肌进行性丢失为特征的消耗性综合征，可伴或不伴脂肪丢失，影响高达80%的癌症患者，尤其在胰腺癌中，约70%的患者在诊断时即表现出恶病质。由于骨骼肌丢失，恶病质会损害运动、姿势控制和呼吸等基本功能，导致身体机能下降、生活质量降低、对癌症治疗的耐受性减弱以及手术并发症增加，最终缩短患者生存期，甚至占所有癌症相关死亡的30%。尽管已有阿那莫林（Anamorelin）在日本获批用于改善食欲，但由于对驱动癌症恶病质的机制认识不足，目前仍缺乏有效的治疗药物。
昼夜节律钟存在于几乎所有哺乳动物细胞中，通过转录因子和自主调节反馈环路驱动24小时节律性基因表达，是组织稳态的关键调控者，协调代谢和免疫功能随时间波动。时钟功能障碍足以引发炎症和代谢紊乱，如葡萄糖稳态受损和脂质代谢改变——这些都是癌症恶病质的关键特征。然而，时钟破坏在癌症恶病质中的作用尚不明确。此前研究主要关注肿瘤对肝脏等外周组织时钟的影响，但生命攸关的心肺肌（如膈肌和心脏）在癌症中也发生萎缩和功能障碍，被认为是恶病质相关发病率和死亡率的重要贡献者。因此，研究人员假设，这些组织中独特的昼夜节律程序也会受到破坏，从而揭示潜在的治疗干预靶点。
研究方法概述
本研究采用原位KPC胰腺癌小鼠模型（KPC FC1245细胞注射入C57BL/6小鼠胰腺），在接种后第12天（对应恶病质起始期）将小鼠置于持续黑暗条件下，每4小时收集一次膈肌和心脏组织，共6个时间点（每组每时间点n=2），进行批量RNA测序。利用LR_rhythmicity R包鉴定节律性表达基因（REGs），以Pc < 0.01为标准；使用LR_diff R包评估昼夜节律模式差异（振幅、相位和基础表达，p < 0.05）。通过DESeq2进行分相位（活跃期和静息期）差异表达基因（DEGs）分析，并使用DAVID进行基因本体论（GO）、KEGG和Reactome通路富集分析。
研究结果
3.1 胰腺癌恶病质中心肺肌的昼夜节律转录组被破坏
在Sham小鼠的膈肌中鉴定出308个REGs，其中64%（197/308）在KPC小鼠中丧失了节律性；而KPC小鼠膈肌中有718个基因获得了节律性。丧失节律性的基因富集于cAMP信号、溶酶体靶向、多梳抑制复合物和p53信号通路，包括Nrf1（调控线粒体稳态和应激反应）、Ncoa5（氨基酸刺激的mTOR信号正调控因子）和Pik3c3（自噬和膜运输关键介质）。获得节律性的基因富集于染色质重塑、炎症（如Tlr7触发先天免疫应答、Il18和Il18r参与炎症信号）、凋亡和蛋白质/细胞器更新，其中Glut4/Slc2a4（胰岛素调控的主要葡萄糖转运蛋白）和Tfeb（自噬-溶酶体系统主调控因子）呈现时间依赖性下调。
在Sham小鼠的心脏中鉴定出1274个REGs，其中56%（709/1274）在KPC小鼠中丧失了节律性；KPC小鼠心脏中有246个基因获得了节律性。丧失节律性的基因富集于心脏功能相关通路，包括β-肾上腺素能和cAMP信号、细胞对胰岛素反应及神经发生，如Ppara（心脏脂肪酸氧化关键调控因子）、Pfkfb2（糖酵解调控因子）、Adcy9（环状AMP形成酶）、Tpm4（原肌球蛋白4）和Atp2a2（编码SERCA2泵）。获得节律性的基因富集于离子和胆固醇运输及氧化解毒，包括Adrb1（编码β1-肾上腺素受体）和Kcnn4（钙激活钾通道），以及炎症相关基因如Ly6c2（髓系细胞标志物）。
3.2 恶病质与支持心肺肌功能的基因网络的时间依赖性破坏相关
在Sham小鼠中，REGs的峰值表达时间均匀分布。但在KPC小鼠膈肌中，这种均匀分布消失，REGs重新聚集在活动结束（CT24，活跃期到静息期转换）和活动开始（CT12，静息期到活跃期转换）附近。这包括脂质代谢和L-亮氨酸细胞反应等代谢过程的节律协调丧失，而炎症反应和泛素依赖性蛋白分解相关基因在这些时间点达到峰值。在KPC小鼠心脏中，虽然整体分布未变，但特定生物过程的时间安排改变：正常情况下在活跃期达峰的心脏率调控基因（Hcn4、Ednra、Pde4d）的节律性丧失，取而代之的是炎症相关过程（Il33、Edn1、Hmgb2）在活跃期达峰。
分相位转录组分析显示，膈肌中活跃期和静息期分别有2330和3096个DEGs。两个相位均显示先天免疫激活上调，但氧化磷酸化和线粒体程序的下调在静息期更为显著。静息期特异性上调基因富集于细胞外基质组织（胶原和ECM重塑基因），而下调基因富集于脂质代谢和脂肪酸氧化（正常应在静息期达峰）。心脏中活跃期和静息期分别有221和371个DEGs，均显示先天免疫激活上调。活跃期特异性上调基因富集于血小板活化，静息期特异性上调基因富集于MHC抗原加工呈递和巨噬细胞标志物，静息期特异性下调基因富集于细胞周期和增殖程序。
3.3 核心时钟基因的抑制发生在恶病质起始之前
利用已发表的KPC小鼠膈肌RNA-seq时间序列数据集（涵盖恶病质前期、轻中度恶病质和终末期），研究人员发现大多数时钟基因在整个恶病质连续过程中均受显著干扰。Bmal1和Clock在接种后第8天即显著受抑并持续保持低表达，表明在恶病质起始前核心时钟激活因子已受转录抑制。次级环路组分Rora和Nr1d1（编码REV-ERBα）也在恶病质诱导前显著受抑，它们不仅稳定时钟振荡，还具有独立于时钟的、维持骨骼肌代谢健康和质量的非时钟功能。
讨论与结论
本研究证实了胰腺癌恶病质与膈肌和心脏中昼夜节律时钟功能障碍之间的联系。研究发现，膈肌中约60%的节律性基因丧失昼夜节律性，核心时钟组分（如Bmal1）的基础表达和/或振幅受抑，脂质和氧化代谢及蛋白质稳态相关的基因网络在静息期受抑，而炎症网络则上调并获得节律性且在静息期达峰。心脏中的破坏涉及β-肾上腺素能和cAMP信号、细胞对胰岛素反应及神经发生等心脏功能基因网络丧失节律性，并伴有更有限的炎症网络上调。值得注意的是，膈肌中核心时钟基因的抑制在恶病质发生之前就已出现，提示早期时钟破坏可能是膈肌萎缩和功能障碍的潜在诱因。这些时间依赖性基因网络变化支持基于时间的治疗干预策略以维持心肺肌质量和功能，并突显靶向昼夜节律机制的治疗潜力。研究结论指出：胰腺癌恶病质与心肺肌中广泛的昼夜节律失调相关，这可能同时导致肌肉萎缩和功能衰退。
