《Stress Biology》：Ubiquitylome analysis reveals the protective effect of α-lipoic acid via the ferroptosis pathway during recovery after hepatic oxidative stress in finishing pigs
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泛素化是一种关键的翻译后修饰，可调节肝脏抗氧化防御。α-硫辛酸（LA）具有强大的肝保护作用，但其在氧化损伤猪肝脏中调节泛素化的机制，尤其是在恢复期，仍不清楚。在本研究中，18头去势雄性大白（LW）猪被随机分配到对照组、敌草快（DQ）组和敌草快+LA（DL，80
泛素化是一种关键的翻译后修饰，可调节肝脏抗氧化防御。α-硫辛酸（LA）具有强大的肝保护作用，但其在氧化损伤猪肝脏中调节泛素化的机制，尤其是在恢复期，仍不清楚。在本研究中，18头去势雄性大白（LW）猪被随机分配到对照组、敌草快（DQ）组和敌草快+LA（DL，800 mg/kg日粮）组。在第15天，DQ组和DL组注射敌草快（8 mg/kg体重），并在第29天采集肝脏组织。基于串联质量标签（TMT）的蛋白质组学分析定量了7,271个鉴定蛋白中的5,326个，并通过平行反应监测（PRM）进行了验证。无标记泛素组学分析鉴定了对应1,446条肽段和594个泛素化蛋白的1,651个泛素化位点，其中1,208个位点、1,058条肽段和489个蛋白被定量。研究人员的发现揭示，在肝脏氧化应激后的恢复期，LA上调了猪肝脏中铁蛋白重链1（FTH1）的表达，并促进了Poly(rC)结合蛋白1（PCBP1）在K314位点的泛素化；这两种蛋白是铁死亡通路中铁储存的核心调节因子。肝脏抗氧化状态和组织病理学分析证实，日粮LA有效平衡了抗氧化系统的代偿性激活，并减轻了氧化应激诱导的肝损伤。基于细胞的实验进一步验证，LA以浓度依赖性方式显著改善了由氧化应激引起的FTH1减少和Fe2?浓度升高。总之，研究人员提出LA通过增强铁螯合、抑制脂质过氧化和抑制铁死亡来保护肝细胞。本研究为LA通过调节铁死亡通路中关键蛋白的表达和泛素化来维持肝脏氧化还原稳态提供了新的见解。
研究背景与科学问题
肝脏作为猪的核心代谢器官，参与营养代谢、毒素降解和免疫调节等众多生理过程，极易受到氧化应激诱导的损伤。在现代集约化养殖体系中，早期断奶、日粮失衡和环境应激等因素会破坏猪肝脏的氧化还原稳态，导致活性氧（ROS）过度积累，不仅损害肝功能、降低生长性能，还严重威胁猪的健康与福利，给养猪业造成巨大经济损失。因此，阐明猪肝脏抗氧化防御系统的分子机制并寻找有效的调控策略成为猪营养与健康领域的研究重点。
铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化物大量积累和铁稳态失衡，广泛参与肝脏疾病的发生与发展。在猪肝脏中，氧化应激诱导的铁死亡已被证明与肝损伤密切相关。然而，铁死亡在猪肝脏中的上游调控机制，尤其是翻译后修饰在调控铁死亡通路中的作用仍有待阐明。泛素化作为一种关键的翻译后修饰，通过E1-E2-E3泛素连接酶级联反应调节靶蛋白的降解、定位和活性，在细胞应激反应、铁稳态调节和铁死亡过程中发挥核心作用。α-硫辛酸（LA）是一种天然的二硫醇化合物，兼具亲脂性和亲水性，被称为“万能抗氧化剂”。先前研究已证实LA可通过抑制铁死亡改善多种疾病模型中的组织损伤，但其作用机制是否与泛素化调控相关尚不明确。
基于LA的金属螯合特性和抗氧化潜力，以及泛素化在铁死亡调控中的核心作用，研究人员推测LA可能通过调控泛素化来靶向铁死亡通路中的关键蛋白，从而改善猪肝脏的抗氧化功能。
研究内容与主要结论
为探究LA在氧化损伤猪肝脏（尤其是恢复期）中通过调节核心功能蛋白丰度和泛素化来调控肝脏抗氧化能力的机制，本研究利用串联质量标签（TMT）联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了不同处理组间猪肝脏的差异表达蛋白（DEPs），并采用平行反应监测（PRM）技术验证候选DEPs的表达变化。同时，通过基于LC-MS/MS的无标记蛋白定量技术对泛素化蛋白进行分析，获得了猪肝脏中差异泛素化蛋白（DUPs）及其相应泛素化位点的定性和定量信息。结合肝脏抗氧化状态和关键蛋白表达的评估，初步探讨了功能性饲料添加剂通过翻译后修饰（PTMs）途径调节机体抗氧化能力的机制。
研究发现，LA在氧化应激恢复期上调了猪肝脏中铁蛋白重链1（FTH1）的表达，并促进了Poly(rC)结合蛋白1（PCBP1）在K314位点的泛素化，这两种蛋白是铁死亡通路中铁储存的核心调节因子。肝脏抗氧化状态和组织病理学分析证实，日粮LA有效平衡了抗氧化系统的代偿性激活，减轻了氧化应激诱导的肝损伤。细胞实验进一步验证，LA以浓度依赖性方式显著改善了氧化应激引起的FTH1减少和Fe2?浓度升高。本研究首次揭示了LA通过调节铁死亡通路中关键蛋白的表达和泛素化来维持肝脏氧化还原稳态的新机制，为功能性饲料添加剂通过翻译后修饰途径调控机体抗氧化能力提供了新的理论依据。
关键技术方法
本研究使用了以下主要技术方法：
- 1.
动物模型建立：选用18头去势雄性大白（LW）猪，随机分为对照组、敌草快（DQ）组和敌草快+LA（DL，800 mg/kg日粮）组。在第15天，DQ和DL组腹腔注射敌草快（8 mg/kg体重），第29天采集肝脏组织。
- 2.
基于TMT的蛋白质组学分析：用于定量鉴定各组间的差异表达蛋白。
- 3.
平行反应监测（PRM）验证：用于验证候选DEPs的表达变化。
- 4.
无标记泛素组学分析：通过免疫亲和富集和质谱分析，鉴定和定量泛素化位点及相应的泛素化蛋白。
- 5.
免疫共沉淀（Co-IP）：验证PCBP1的泛素化水平。
- 6.
细胞实验：使用转化人肝上皮-2（THLE-2）细胞进行体外验证。
研究结果
Effects of LA on protein abundance and ubiquitination in porcine liver during recovery after oxidative stress
通过TMT联合LC-MS/MS分析，共鉴定到7,271个蛋白，其中5,326个被定量；泛素组学分析鉴定到594个泛素化蛋白、1,446条泛素化肽段和1,651个泛素化位点，其中1,208个位点和1,058条肽段可被定量。46.97%的蛋白含有两个以上泛素化位点。组间比较显示，DQ vs CK组有13个DEPs（上调5个，下调8个），DL vs CK组有54个DEPs（上调28个，下调26个），DL vs DQ组有21个DEPs（上调13个，下调9个）。在泛素化水平上，DQ vs CK组有38个差异泛素化位点（上调20个，下调18个），DL vs CK组有39个（上调22个，下调17个），DL vs DQ组有30个（上调15个，下调15个）。
Biological function analysis of DEPs and DUPs
亚细胞定位分析表明，DEPs和DUPs主要分布在细胞质和细胞核中。蛋白结构域分析显示，DEPs主要与铁蛋白样结构域、金属硫蛋白等相关，DUPs主要与细胞色素P450、泛素羧基末端水解酶等相关。KEGG富集分析发现，DL vs DQ组的DEPs显著富集在矿物质吸收、铁死亡等通路；DUPs显著富集在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、FoxO、AMPK、胰岛素和胰高血糖素信号通路等。GO分析显示，DEPs和DUPs均显著富集在铁离子结合和转运、氧化还原酶活性等条目。
Validation by parallel reaction monitoring (PRM)
PRM验证结果显示，候选DEPs的蛋白丰度变化趋势与TMT分析结果一致，证实了蛋白质组学数据的可靠性。
Quantitative Western blot validation of ferritin heavy chain 1 (FTH1) protein expression trends
Western blot结果显示，DL组肝脏FTH1蛋白水平数值上高于DQ组（p=0.054，边缘显著性），与蛋白质组学筛选趋势一致，表明日粮LA在氧化应激恢复期上调了肝脏FTH1表达。
Co-immunoprecipitation (Co-IP) reveals that LA promotes poly(rC)-binding protein 1 (PCBP1) ubiquitination in porcine liver during recovery after oxidative stress
Co-IP结果表明，DL组免疫沉淀的PCBP1总泛素化水平较DQ组显著升高，直接验证了LA促进PCBP1泛素化的蛋白质组学观察结果。
Antioxidant status regulated by LA in porcine liver during recovery after oxidative stress
在恢复期采样阶段，DQ组肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性较CK组显著升高，表明抗氧化系统可能存在过度激活。DL组多数指标介于CK和DQ组之间，表明LA补充有助于缓解过度激活的肝脏抗氧化系统。HE染色显示，氧化应激挑战猪的肝脏出现微空泡增多、双核肝细胞和轻度窦状隙扩张充血，而LA补充减轻了这些损伤。
Regulation of antioxidant levels by LA in transformed human liver epithelial-2 (THLE-2) cells under oxidative stress
200、400和800 μM的LA均显著缓解了H?O?诱导的FTH1蛋白表达下降和Fe2?浓度升高，并以浓度依赖性方式显著提高了细胞活力，降低了丙二醛（MDA）含量，恢复了总SOD和铜锌SOD活性。
讨论与结论
讨论部分指出，敌草快（DQ）诱导的氧化损伤在恢复期出现了抗氧化系统的代偿性激活，表现为SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高，这与采样时间点处于急性氧化冲击后的恢复后期有关。LA补充使大多数指标介于对照和DQ组之间，表明LA能够缓冲过度的应激反应，维持机体的抗氧化稳态。
在铁死亡通路中，LA通过上调FTH1表达增强铁的螯合储存能力，并通过促进PCBP1在K314位点的泛素化来调节铁伴侣功能，从而抑制铁死亡。FTH1作为铁蛋白的功能亚基，可将Fe2?转化为Fe3?并螯合在铁蛋白内，抑制Fenton反应介导的ROS产生。PCBP1作为铁伴侣蛋白，可将铁递送至铁蛋白。LA通过调控这两个关键蛋白，增强了铁螯合、抑制了脂质过氧化和铁死亡。
研究结论：研究人员提出LA通过增强铁螯合、抑制脂质过氧化和抑制铁死亡来保护肝细胞。本研究为LA通过调节铁死亡通路中关键蛋白的表达和泛素化来维持肝脏氧化还原稳态提供了新的见解。
