《Apoptosis》：GLG1 in cancer-associated fibroblasts promotes bladder cancer growth while limiting tumor apoptosis
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癌症相关成纤维细胞（CAFs）塑造膀胱癌进展，但具有功能相关性的CAF相关驱动因素仍未被充分表征。本研究旨在鉴定具有转化意义的CAF富集基因，并确定GLG1是否介导膀胱癌中的肿瘤-间质串扰。研究人员将来自膀胱癌组织的单细胞RNA测序与孟德尔随机化、贝叶斯共定位
癌症相关成纤维细胞（CAFs）塑造膀胱癌进展，但具有功能相关性的CAF相关驱动因素仍未被充分表征。本研究旨在鉴定具有转化意义的CAF富集基因，并确定GLG1是否介导膀胱癌中的肿瘤-间质串扰。研究人员将来自膀胱癌组织的单细胞RNA测序与孟德尔随机化、贝叶斯共定位、相关性分析、临床标本免疫染色、CAF条件培养基实验、GLG1敲低/过表达、TGF-β1/Smad2/3评估以及异种移植建模相结合。对9例膀胱癌样本的单细胞分析保留了60,561个细胞，并鉴定了成纤维细胞富集的转录程序。在960个成纤维细胞富集基因中，孟德尔随机化确定了22个基因，其遗传预测表达与膀胱癌风险相关，共定位分析优先排序了GLG1、HES4和HSP90B1。研究人员选择GLG1进行验证，因为它表现出成纤维细胞富集表达、膀胱癌关联的遗传学支持以及共享的cis-eQTL/GWAS信号。GLG1在肿瘤组织中的表达高于癌旁正常组织，与间质定位模式一致，且GLG1阳性与肿瘤侵袭性相关。肿瘤来源的TGF-β1/Smad2/3信号传导有助于成纤维细胞中GLG1的上调。CAF条件培养基增强了EJ-1细胞的活力、迁移和Matrigel侵袭；这些效应在CAFs中通过GLG1沉默而减弱，并通过GLG1过表达而增强。在异种移植模型中，与CAFs-shNC相比，CAFs-shGLG1减少了肿瘤生长和Ki-67阳性率，并增加了TUNEL阳性肿瘤细胞；而CAFs-OE-GLG1显示出相反的Ki-67和TUNEL染色模式。CAF相关GLG1通过可能增强肿瘤-间质串扰，促进膀胱癌细胞活力、迁移、Matrigel侵袭和异种移植生长，同时限制肿瘤细胞凋亡。这些发现支持GLG1作为参与膀胱癌进展的间质因子，并为进一步评估其生物标志物潜力和治疗相关性提供了基础。
膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有临床异质性，可从复发性非肌层浸润性肿瘤进展为高发病率和高死亡率的肌层浸润性及转移性疾病。临床决策主要依赖病理分级、侵袭状态和风险分层，但这些变量不能完全解释癌症进展的机制。肿瘤进展不仅受肿瘤细胞自身改变影响，还受肿瘤微环境（TME）中细胞与细胞外基质（ECM）成分相互作用的调控。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是异质性成纤维细胞谱系群体，可获得肌成纤维细胞样特征，表达α-SMA和FAP等标志物，并通过旁分泌信号调节肿瘤细胞迁移、血管生成、免疫逃逸和治疗耐药。然而，单个CAF相关基因如何具体促进膀胱癌细胞活力、增殖和迁移仍不明确。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可将候选基因表达定位至特定细胞群体，但仅凭细胞类型表达模式无法确定基因是否与疾病活性相关。孟德尔随机化（MR）和贝叶斯共定位分析可评估遗传预测基因表达与癌症风险的关系，以及表达数量性状位点（eQTL）信号与全基因组关联研究（GWAS）信号是否共享因果变异。因此，研究人员整合单细胞转录组学、遗传学分析、临床验证以及体内外实验，系统鉴定具有生物学和转化意义的CAF相关因子。
该研究以公共数据集GSE222315中9例膀胱癌样本的scRNA-seq数据为基础，结合eQTLGen的cis-eQTL数据和IEU OpenGWAS（ieu-b-4874）的膀胱癌GWAS数据进行MR与贝叶斯共定位分析，并通过临床标本免疫染色、CAF条件培养基实验、GLG1敲低/过表达、TGF-β1/Smad2/3通路评估及异种移植模型，验证GLG1在肿瘤–间质串扰中的作用。结果表明，CAF相关GLG1通过增强肿瘤–间质串扰，促进膀胱癌细胞活力、迁移、Matrigel侵袭和异种移植生长，同时限制肿瘤细胞凋亡；肿瘤来源的TGF-β1/Smad2/3信号参与成纤维细胞活化及GLG1上调。这些发现支持GLG1作为膀胱癌进展相关的间质因子，具有生物标志物和治疗靶点的潜在价值。
在关键技术方法方面，研究人员使用GEO数据集GSE222315中9例膀胱癌样本的scRNA-seq数据，经质量控制、双细胞去除及Harmony整合后保留60,561个细胞；利用eQTLGen和IEU OpenGWAS（ieu-b-4874）的汇总数据开展两样本MR及贝叶斯共定位；对35例临床膀胱癌组织标本进行免疫组织化学和双重免疫荧光染色（其中30例有完整侵袭状态和组织学分级信息）；使用CAF条件培养基处理EJ-1膀胱癌细胞，开展CCK-8、Transwell和伤口愈合实验；通过siRNA、shRNA和过表达质粒调控CAF中GLG1表达；使用T24细胞和BALB/c裸鼠建立皮下异种移植模型。
研究结果包括以下方面。第一，单细胞分析将GLG1定位于间质成纤维细胞/CAFs。scRNA-seq分析保留60,561个细胞，注释出上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和肥大细胞七种主要细胞类型。GLG1在成纤维细胞中的平均表达高于其他大多数细胞类型，约50%的成纤维细胞表达GLG1，提示GLG1是成纤维细胞富集的候选基因。第二，MR和共定位分析在成纤维细胞富集基因中鉴定出GLG1、HES4和HSP90B1。差异表达分析共获得960个成纤维细胞相关DEG，MR分析筛选出22个基因的遗传预测表达与膀胱癌风险相关，贝叶斯共定位进一步将GLG1、HES4和HSP90B1列为候选基因。其中，GLG1的遗传预测表达与较低的膀胱癌风险相关，敏感性分析支持结果的稳健性，GLG1基因座上的rs16943885同时与GLG1表达和膀胱癌风险关联。第三，GLG1参与成纤维细胞为中心的通讯、通路特征、免疫调控和成纤维细胞状态动态。CellChat分析显示成纤维细胞与其他细胞存在广泛通讯，包括PTN、MDK、MIF等配体–受体对；GLG1表达与趋化因子信号、JAK–STAT信号和PI3K–Akt信号相关；GLG1高表达样本富集上皮–间质转化、TGF-β信号、血管生成等程序。CIBERSORT分析显示GLG1表达与M0、M1和M2巨噬细胞及静息CD4记忆T细胞正相关，与记忆B细胞、活化树突状细胞等负相关。拟时间分析显示GLG1表达随成纤维细胞状态出现分布变异。第四，免疫染色分析支持GLG1在膀胱癌间质中富集。免疫组织化学显示GLG1阳性细胞百分比在侵袭性肿瘤中高于癌旁正常组织和非侵袭性肿瘤；TGF-β1在肿瘤组织中高于正常组织。双重免疫荧光显示GLG1阳性细胞与α-SMA阳性成纤维细胞在侵袭性肿瘤间质中共定位，Western blot证实肿瘤组织中GLG1蛋白表达高于癌旁组织。第五，肿瘤细胞条件培养基通过TGF-β1/Smad2/3信号部分诱导成纤维细胞活化和GLG1上调。BIU-87和EJ-1细胞条件培养基以时间依赖性方式上调正常成纤维细胞中GLG1表达；抗TGF-β1抗体可部分减弱该上调，并降低FAP、α-SMA和p-Smad2/3的表达，而总Smad2/3不变。第六，CAF相关GLG1在体外促进EJ-1细胞活力、Matrigel侵袭和伤口闭合。RT-qPCR确认si-GLG1-1有效敲低和GLG1过表达效果；CAF条件培养基增加EJ-1细胞活力、侵袭和迁移能力，GLG1沉默减弱这些效应，GLG1过表达则增强。第七，CAF相关GLG1在体内促进异种移植肿瘤生长。与CAFs-shGLG1 NC组相比，CAFs-shGLG1组肿瘤体积和重量降低，Ki-67阳性率下降，TUNEL阳性率升高；CAFs-OE-GLG1组则显示相反的Ki-67和TUNEL染色模式。
在讨论部分，研究人员指出，既往研究已表明GLG1参与配体结合和成纤维细胞生长因子信号，但其在膀胱癌肿瘤–间质相互作用中的作用尚不清楚。本研究通过多种方法证明，GLG1在膀胱癌间质中富集，且CAF中GLG1表达改变可影响膀胱癌细胞的恶性表型。研究也存在局限性：组织样本量较小；scRNA-seq仅基于单一公共数据集；体外实验使用特定膀胱癌细胞系，异种移植模型仅使用T24细胞系；计算分析范围大于实验验证范围，CellChat和免疫相关性分析提示GLG1可能与内皮和免疫细胞存在关联，但功能性实验仅验证了CAF–肿瘤细胞轴，内皮和免疫相关结果属于假设生成性质，未经实验确认。未来需要整合独立单细胞队列、多细胞功能系统以及包含血管和免疫组分的体内模型，以确定GLG1修饰的CAFs是否直接调控这些细胞区室。
研究结论可翻译为：在所研究的模型中，CAF相关GLG1通过增强肿瘤细胞活力、迁移、Matrigel侵袭和异种移植生长，同时限制肿瘤细胞凋亡，从而支持膀胱癌进展。肿瘤来源的TGF-β1/Smad2/3信号传导有助于成纤维细胞活化和GLG1上调。这些发现为进一步评估GLG1作为间质生物标志物及其在膀胱癌中的治疗相关性提供了基础。
