《Advanced Biotechnology》：hTERT-immortalized mouse alveolar macrophages retain primary-like transcriptional and functional programs
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肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs）是肺肺泡中最丰富的免疫细胞，是对呼吸道病原体的第一道防线，同时维持肺稳态。然而，原代AMs的获取受限于支气管灌洗且每只小鼠仅能获得20万至50万细胞，制约了后续研究。已有细胞系如MH-S（经SV
肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs）是肺肺泡中最丰富的免疫细胞，是对呼吸道病原体的第一道防线，同时维持肺稳态。然而，原代AMs的获取受限于支气管灌洗且每只小鼠仅能获得20万至50万细胞，制约了后续研究。已有细胞系如MH-S（经SV40 T抗原永生化）缺乏AM标志物Siglec-F且不表达CD116，对GM-CSF无反应并对LPS低反应；AMJ2-C8和AMJ2-C11（经v-raf/v-myc癌基因转导）对LPS和MDP反应异常。端粒酶逆转录酶（hTERT）已被成功用于多种原代细胞永生化而不改变其表型。研究人员利用慢病毒系统在原代小鼠AMs中过表达hTERT，经嘌呤霉素筛选和单克隆分离，建立了四个稳定的hTERT永生化AM（iAM）细胞系。iAM细胞增殖稳定，倍增时间约12小时，几乎全部为Ki67阳性且EdU掺入显著高于原代细胞。形态学上iAMs与原代AMs相似，但伪足形成减少。转录组分析显示iAMs在PCA分析中更接近原代AMs而非AM样细胞或骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），功能模块评分显示iAMs在溶酶体、吞噬、氧化磷酸化、趋化和M2特征方面与原代AMs高度相似，而抗原呈递评分更高。流式细胞术证实iAMs保留AM特征性表面表型F4/80int、CD11blow、Siglec-Fhigh和CD11chigh。功能上，iAMs对eYFP标记的大肠杆菌表现出优于原代AMs的吞噬活性，对铜绿假单胞菌的趋化迁移能力增强，并对LPS、LTA或灭活铜绿假单胞菌产生与原代AMs相当的炎症反应。体内实验中，经氯膦酸盐脂质体耗竭AMs后气管内移植iAMs，PKH26标记的iAMs在14天观察期内持续存在，且iAM重建显著减轻了铜绿假单胞菌诱导的肺损伤，恢复了细菌清除并限制了中性粒细胞浸润。研究结果表明iAM细胞能稳定增殖，保留原代AMs的关键表型和转录特征，部分重现AMs的标志性功能，并在体内恢复肺防御功能，为研究AM生物学提供了有用的细胞系统。
hTERT永生化小鼠肺泡巨噬细胞保留原代样转录与功能程序：论文解读
一、研究背景与意义
肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs）是肺肺泡中最丰富的免疫细胞，作为抵御呼吸道病原体的第一道防线，同时维持肺稳态。静息状态下AMs呈现免疫抑制表型以防止对无害刺激产生过度炎症；遭遇病原体时则启动炎症反应，包括抗原呈递、中性粒细胞募集和促炎细胞因子产生。此外，AMs还参与多种肺部疾病的发病机制，因此理解其生物学特性具有重要意义。然而，原代AMs的获取受到严重制约：其分离需对实验动物进行支气管灌洗，每只小鼠仅能获得20万至50万个细胞，限制了下游应用。为满足研究需求，已有多种AM细胞系被开发，但均存在明显缺陷：AMJ2-C8和AMJ2-C11细胞系由v-raf/v-myc癌基因转导产生，对LPS和MDP反应异常，且无法分泌足量IL-1和TNF；广泛使用的MH-S细胞系经SV40 T抗原永生化，缺乏AM标志物Siglec-F且不表达CD116，对GM-CSF无反应并对LPS低反应；骨髓前体细胞经GM-CSF、TGF-β和罗格列酮分化获得的AM样细胞虽可部分模拟AM特征，但未永生化且扩增能力有限。因此，现有模型均未能完全重现原代AM的特征。端粒酶逆转录酶（hTERT）已被成功用于多种原代细胞永生化而不改变其表型。研究人员据此利用hTERT建立永生化AM细胞系（iAM），系统评估其增殖能力、表面标志物表达、转录谱及吞噬、趋化和细胞因子产生等功能活性，并通过过继转移至AM耗竭小鼠评估体内功能，旨在提供更忠实于原代AM的细胞模型。
二、主要技术方法
研究人员使用C57BL/6小鼠（6-8周龄，购自中山大学实验动物中心），从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离原代AMs。通过hTERT编码慢病毒（MOI: 10）转导原代AMs，经嘌呤霉素筛选和单克隆分离建立iAM细胞系。主要技术方法包括：bulk RNA-seq转录组分析、流式细胞术检测表面标志物和增殖指标、qRT-PCR验证基因表达、eYFP标记大肠杆菌吞噬实验、Transwell趋化实验、透射电镜和扫描电镜形态学观察，以及体内AM耗竭和重建模型（氯膦酸盐脂质体耗竭后气管内移植iAMs并铜绿假单胞菌攻毒）。
三、研究结果
iAM细胞的建立及增殖与形态特征。 经hTERT慢病毒转导、嘌呤霉素筛选和单克隆分离，建立了四个稳定的iAM细胞系，均经PCR确认无支原体污染且形态、表面标志物和增殖能力相当，选取一个代表性克隆用于后续实验。STR分型确认iAM细胞系源自原代AMs。hTERT mRNA仅在iAMs中可检测到。iAMs活跃增殖，倍增时间约12小时，几乎所有iAMs均为Ki67阳性，EdU掺入显著高于原代细胞。形态学上，iAMs在明场和透射电镜下与原代AMs相似，Giemsa和油红O染色模式一致；扫描电镜显示iAMs保持原代AMs的球形形态，但伪足形成减少。
转录组、分子和功能验证。 Bulk RNA-seq主成分分析显示iAMs比AM样细胞或BMDMs更接近原代AMs，转录距离显著更小。配对相关性分析确认iAMs与原代AMs具有更高的转录相似性。层次聚类热图显示iAMs在大多数基因模块中呈现与原代AMs高度相似的表达模式。差异表达分析鉴定出2,953个差异表达基因（|log?FC|≥1且P.adj<0.05），其中1,440个上调、1,513个下调，KEGG富集分析显示主要富集于免疫信号和代谢通路。功能模块评分显示iAMs在溶酶体、吞噬、氧化磷酸化、趋化和M2特征方面与原代AMs高度相似，而抗原呈递评分更高。靶向热图显示iAMs强表达AM特异性标志物，而AM样细胞呈现混合AM/BMDM特征。流式细胞术确认iAMs保留F4/80int、CD11blow、Siglec-Fhigh和CD11chigh的AM特征性表面表型。qRT-PCR验证iAMs表达与原代AMs相当水平的AM特异性基因、替代激活基因和自我更新基因。吞噬实验显示iAMs对eYFP标记大肠杆菌的吞噬活性优于原代AMs和AM样细胞。Transwell趋化实验显示iAMs对铜绿假单胞菌的迁移能力较原代AMs增强。此外，iAMs对LPS、LTA或灭活铜绿假单胞菌的炎症反应与原代AMs相当。
体内功能重建。 研究人员建立氯膦酸盐脂质体AM耗竭和重建模型，耗竭效率约95.7%。气管内移植iAMs后实现肺泡空间稳定植入。PKH26标记的iAMs在14天观察期内持续存在，第14天时转移的PKH26阳性iAMs占CD11c阳性群体的50%以上。AM耗竭小鼠出现严重肺损伤，表现为血性BALF、BALF浊度（OD???）增加、总蛋白升高、中性粒细胞过度浸润和高细菌载量。iAM重建显著减轻所有病理特征，恢复细菌清除并限制中性粒细胞募集，表明iAM细胞可在体内功能性替代内源性AMs参与肺宿主防御。
四、讨论与结论
研究人员指出，尽管BMDMs和单核细胞来源巨噬细胞长期作为替代模型，但这些模型在发育起源、转录编程和功能谱方面与组织驻留巨噬细胞存在根本差异。现有AM细胞系经癌基因介导的永生化改变了转录编程并导致异常功能反应，包括丧失典型AM表面标志物和异常细胞因子产生。iAM细胞系在保持稳定增殖的同时保留关键AM表面标志物（Siglec-F? CD11c? F4/80? CD11b???）并表达AM特异性基因，功能上重现原代AMs的标志性活动，包括吞噬、趋化和细胞因子产生。过继转移至AM耗竭小鼠后成功植入并改善铜绿假单胞菌诱导的肺损伤。研究也指出iAM模型的局限性：iAMs虽重现原代AMs的许多表型特征，但并非完全镜像新鲜分离细胞的所有功能特性，如抗原呈递能力增强和伪足减少；永生化及长期体外扩增可能引入遗传或表观遗传改变并促进克隆选择。研究人员建议在限定传代范围（P1-P12）内使用iAMs并常规监测关键AM标志物和功能表型，在需要高生物学保真度时以原代AMs验证关键发现。总之，研究人员报告建立了比现有模型更忠实重现原代细胞特征的hTERT永生化小鼠AM细胞系，为肺免疫学、宿主防御和肺稳态研究提供了有价值的细胞平台。
