《Molecular Phylogenetics and Evolution》：An updated phylogenomic tree of Coleoptera (beetles)
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基于3,727个BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）基因，研究人员构建了一个针对鞘翅目（Coleoptera）亚科级分辨率的综合系统发育基因组树。采用基于树形和比对标准的严格位点过滤策略，有效提
基于3,727个BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）基因，研究人员构建了一个针对鞘翅目（Coleoptera）亚科级分辨率的综合系统发育基因组树。采用基于树形和比对标准的严格位点过滤策略，有效提升了基因一致性因子（gene concordance factors, gCF）并降低了计算成本。在PMSF（Posterior Mean Site Frequency）、Dayhoff6和LG（Le & Gascuel）模型下，对于中等基因占有率的完整分类单元矩阵，所获优选树拓扑结构高度一致；而GHOST（General Heterogeneous evolution On Separate Trees）模型则在谱系特异性速率变异条件下产生了合理的替代拓扑。通过与既往研究的正式节点比较，本研究总结了鞘翅目系统发育基因组学的当前进展。
鞘翅目系统发育基因组学更新：基于大规模BUSCO基因与严格位点过滤的综合分析
一、研究背景与科学问题
鞘翅目（Coleoptera）作为昆虫纲中物种最丰富、生态多样性最高的类群，拥有超过40万已描述物种，占据几乎所有陆地和淡水栖息地。理解这一惊人多样性的演化历程，亟需一个稳健的系统发育框架。然而，尽管此前多项基因组尺度研究——如McKenna等（2019）基于转录组数据建立了首个涵盖所有亚目和总科的系统发育框架，后续研究又聚焦于特定亚目或科级水平——但若干深部节点仍存争议。这些争议反映了分类单元选择、基因组方法论以及核苷酸演化模型等方面的差异。特别是，在多食亚目（Polyphaga）内部，多个基于分子数据识别出的深部分支物种贫乏，包括位于亚目基部附近的“祖先五科”、与所有传统下目呈姊妹关系的单种属Rhinorhipus，以及被置于除花甲下目（Elateriformia）之外所有下目姊妹群的小型科Nosodendridae。这些深部分支已被赋予新的高级分类单元名称（Scirtiformia、Rhinorhipiformia和Nosodendriformia），但在广泛接受之前仍需更充分的验证。此外，隐翅虫下目（Staphyliniformia）内最大科Staphylinidae在系统发育基因组研究中代表性不足，花甲下目内Dryopoidea和Byrrhoidea总科的组成及互斥单系性存疑，扁甲下目（Cucujiformia）内Cleroidea、Coccinelloidea和Tenebrionoidea之间的关系亦不稳定。因此，亟需更大分类深度和节点支持度的系统发育框架来解决这些基础性问题。
二、研究内容与主要发现
为解决上述问题，研究人员基于大幅扩展的基因组资源，构建了更新的鞘翅目系统发育基因组框架。研究人员从公开可用的基因组组装、重新处理的序列读长档案（Sequence Read Archive, SRA）数据以及新测序的基因组数据中，利用鞘翅目特异性BUSCO基因集提取直系同源位点，并通过多阶段过滤策略结合序列和树形标准，识别受隐藏旁系同源、比对不良、组成异质性和速率异质性影响的位点。随后，研究人员采用串联法和溯祖法两种途径，评估了位点过滤、矩阵完整性和替代演化模型的影响。最终获得了目前亚科级水平上采样密度最高的鞘翅目系统发育基因组假说。通过密集的分类单元采样与严格位点过滤相结合，研究旨在减少误导性位点的影响，提升整个甲虫树的节点一致性。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：（1）数据获取与组装：从NCBI GenBank下载已组装基因组，从NCBI SRA获取原始基因组和转录组读段，并结合SITE-100倡议采集的新鲜标本进行新测序；针对不同测序平台（Illumina短读长、PacBio HiFi/CLR、Oxford Nanopore）分别采用MEGAHIT、Hifiasm、Flye等工具进行组装。（2）BUSCO评估与分类单元筛选：使用BUSCO v6.0.0以鞘翅目特异性参考集（coleoptera_odb12，3,729个直系同源基因）评估组装完整性，按亚科级别保留最高质量代表，最终获得263种鞘翅目和13个外群类群。（3）直系同源基因提取与过滤：采用MAGUS进行氨基酸序列比对，trimAl修剪，TreeShrink去除异常长枝序列；随后应用PhyKIT和IQ-TREE进行八项比对和树形质量标准筛选，最终保留2,280个位点。（4）超矩阵构建与系统发育推断：使用FASconCAT按五个分类单元占有率阈值（50%-90%）连接位点，在IQ-TREE中分别采用分区LG、GHOST（LG+FO+H4）、PMSF（LG+C20+FO+R）和Dayhoff6模型进行分析，同时使用ASTER（ASTRAL-IV、wASTRAL）进行溯祖分析。（5）支持度与拓扑评估：采用UFBoot、SH-aLRT、基因和位点一致性因子（gCF、sCF）评估支持度，通过AU/KH/SH检验和RF/GRF距离比较拓扑结构。
四、主要研究结果
3.1 数据生成与分类单元选择
经质量控制、组装和冗余过滤后，最终数据集包含696种独特甲虫，代表23个总科、108科和222亚科。其中，60个为本研究新测序样本，32个满足保留标准纳入最终树。组装完整性在不同测序平台间差异显著：长读长组装（PacBio HiFi、CLR、ONT）一致达到>90%的单拷贝BUSCO完整性，而Illumina双端短读长基因组组装通常低于50%。最终选择263种甲虫加13个外群类群用于树重建。
3.2 连接矩阵与位点过滤
初始数据集包含3,729个位点。经逐步过滤（包括去除低信息含量位点、高组成变异性位点、违反平稳可逆同质条件的位点、极端进化速率位点、低四分体分辨率位点、低平均自展支持度位点、高分子钟偏离度位点和低信号噪声比位点），最终保留2,280个位点。基于50%-90%分类单元占有率阈值构建五个连接超矩阵，其中60%矩阵（2,150个位点）被认为是最佳权衡方案。
3.3 树搜索与拓扑比较
Robinson-Foulds距离分析表明，在50%-70%占有率矩阵下，LG、Dayhoff6和PMSF模型推断的树高度一致并紧密聚类。GHOST模型形成的树形成独立簇。溯祖方法（ASTRAL）的物种树远离所有连接法簇。90%占有率矩阵在所有模型中均为离群值。保留与排除位点分区之间的拓扑差异较小，但保留分区的基因一致性因子（gCF）显著更高。PMSF-60树被选为参考拓扑。
3.4 鞘翅目系统发育关系
基于PMSF-60树的深部拓扑符合广泛接受的基部分裂模式：多食亚目与（肉食亚目（原鞘亚目+藻食亚目））。在多食亚目内部，早期分歧谱系的顺序符合“祖先五科”的连续分化模式：花甲科（Scirtidae）首先分离，随后是球甲科（Clambidae）+Laricobius（Derodontidae），然后是Rhinorhipidae，之后花甲下目与其他多食亚目下目分离。Nosodendridae作为所有剩余多食亚目的姊妹群，随后呈现（隐翅虫下目（长蠹下目+扁甲下目））的拓扑，粪金龟下目嵌套在隐翅虫下目内部。在各下目内部，花甲下目、隐翅虫下目、长蠹下目和扁甲下目的关系均得到详细解析，多数与先前研究一致。
3.5 支持度与不确定性区域
在四种节点支持度指标中，仅有基因一致性因子（gCF）能够有效区分争议性节点与稳健节点。UFBoot和SH-aLRT在96%的节点处达到≥95%，呈饱和状态。采用gCF=15作为截止值，研究发现深部亚目关系仍未解决，扁甲下目内总科间的相互关系存在显著不确定性。低支持度节点集中在花甲总科内的科级水平、扁甲总科内的扁甲亚谱系、拟步甲总科内部，以及隐翅虫科和象虫科的亚科级水平。GHOST模型提供了合理的替代拓扑，而ASTRAL-IV模型导致若干类群的单系性丧失。
五、讨论与结论
本研究通过新增BUSCO基因集以实现更佳的位点覆盖和更密集的分类单元采样，为鞘翅目提供了更新的系统发育基因组框架，目前涵盖约541个亚科中的210个以及另外40个未细分亚科的科。数据集利用了新可用的基因组资源，包括长读长基因组组装和本研究对先前采样不足谱系进行的鸟枪测序，辅以对少数现有转录组的重新组装。直系同源基因使用近期可用的coleoptera_odb12集提取，而非以往研究使用的更宽泛节肢动物集，从而提高了分类特异性并降低了提取旁系同源基因的风险。
在方法论方面，研究人员将大量工作投入到位点过滤，旨在获得经验证的直系同源基因集，确保高数据完整性、最小化速率和核苷酸组成的异质性偏差，以及高系统发育信息含量。直系同源性主要通过BUSCO提取时仅保留完整和片段化的单拷贝直系同源基因并排除所有重复BUSCO来保证。随后两步进一步移除了残留的非直系同源数据：首先使用TreeShrink修剪单个长枝离群序列；其次，位点级过滤丢弃了异常长枝暗示错配、隐藏旁系同源或测序伪迹的整个位点。基于系统发育信息含量的过滤对数据集组成影响最大。总体而言，这些过滤步骤使初始coleoptera_odb12位点集减少了三分之一以上。
许多被排除的位点同时违反了多个标准，反映了不同系统误差来源之间的复杂相互作用。使用类时钟、非饱和且组成均一的基因通常被认为能为深部系统发育提供更可靠的结果，但代价是丢失大量数据。本研究表明，排除位点单独产生的树与高质量对应树之间的距离很小，表明即使是被排除的部分也超过了克服单个位点缺陷所需的总数据量。然而，排除位点的个体树质量和与连接树的一致性较低，体现在基因一致性因子的强烈降低上。
在计算效率方面，ASTRAL分析的内存需求和CPU时间最低，Dayhoff6氨基酸重编码搜索次之，LG和GHOST搜索需数天，而PMSF搜索耗时最长且内存需求极大。保留分区的计算成本低于未过滤分区，且随着矩阵严谨性提高而降低。
本研究的主要结论是：通过密集的分类单元采样与严格位点过滤相结合，能够有效减少误导性位点的影响并提升节点一致性。PMSF-60树作为最参数丰富的位点异质性模型与最佳位点保留权衡的组合，被确定为参考拓扑。大多数普遍恢复的节点在本研究中得到确认，同时若干仅在部分现有研究中恢复的节点也得到了验证。然而，深部亚目关系仍未解决，扁甲下目内总科间的相互关系存在显著不确定性，这反映了分类单元选择、基因组方法和核苷酸演化模型的持续影响。未来的研究应继续扩大分类单元采样，特别是针对当前代表性不足的谱系，并进一步完善位点过滤策略和演化模型，以最终实现鞘翅目系统发育的全面解析。
