《European Journal of Human Genetics》：Biallelic DAW1 variants reveal a tissue-specific role in heterotaxy without primary ciliary dyskinesia
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动纤毛（motile cilia）缺陷导致一系列疾病，包括异位综合征（heterotaxy，HTX）、先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）和原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）。
动纤毛（motile cilia）缺陷导致一系列疾病，包括异位综合征（heterotaxy，HTX）、先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）和原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）。尽管这些疾病常同时出现，但组织特异性表现的遗传和机制基础仍知之甚少。本研究中，研究人员在一个表现为HTX/偏侧性缺陷谱、合并复杂CHD但无心脏外器官错位且无PCD证据的先证者中，鉴定出动力臂装配因子（dynein arm assembly factor）DAW1的复合杂合变异。全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）揭示了一个母源遗传的经典剪接位点变异（c.648+1 G>A，chr2:227,903,110 G>A（GRCh38））和一个父源遗传的错义变异（c.341 G>A；p.Arg114Gln，chr2:227,893,818 G>A（GRCh38）），二者在ACMG/AMP指南下均被归类为意义不明确的变异（variant of uncertain significance，VUS）。研究人员利用Xenopus tropicalis证明，Daw1缺失会破坏左右轴模式（left–right patterning）、心脏环化（cardiac looping）和黏液纤毛流（mucociliary flow），这些表型均可被野生型人DAW1拯救。对患者等位基因的功能检测显示出显著的组织特异性：p.Arg114Gln可拯救黏液纤毛流但不能恢复左右轴模式，而剪接位点变异在两种情境中均导致完全丧失功能。这些发现与先证者的临床表型高度吻合，并为将c.648+1 G>A重新分类为可能致病性（likely pathogenic）、将p.Arg114Gln归类为情境依赖性亚等位基因（context-dependent hypomorphic allele）提供了强有力的功能证据。本研究确立了解读DAW1变异的功能标准，揭示了发育情境如何阐明基因型–表型关系，并强调了体内模型如何支持对未决HTX相关变异进行ACMG重新分类。
研究背景与目的
动纤毛（motile cilia）是高度保守的微管-based突起，在胚胎左右轴模式建立和呼吸道黏液清除等生理过程中发挥关键作用。动纤毛功能缺陷可导致异位综合征（heterotaxy，HTX）、先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）和原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）等一系列疾病，且这些疾病经常共现。然而，同一纤毛基因的变异为何在不同组织中产生不同临床表现，其遗传和机制基础仍不清楚。PCD以气道黏液纤毛清除受损为特征，约12%的PCD患者合并HTX，而HTX常伴随复杂CHD，致死率和心血管并发症负担高。既往研究提示DAW1这一动力臂装配因子在动物模型中参与纤毛结构和功能，人类DAW1变异也被预测与HTX、CHD和慢性呼吸道症状相关，但多数变异仅被归类为意义不明确的变异（variant of uncertain significance，VUS），现有计算工具难以判断其致病性。因此，研究人员利用患者来源的DAW1变异，在Xenopus tropicalis体内模型中进行功能验证，以揭示DAW1的组织特异性作用并支持ACMG/AMP指南下的变异重分类。
研究人员在一个表现为HTX/偏侧性缺陷谱、合并复杂CHD但无PCD证据的男性先证者中，通过全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）发现DAW1复合杂合变异：母源遗传的经典剪接位点变异c.648+1 G>A和父源遗传的错义变异c.341 G>A（p.Arg114Gln）。利用X. tropicalis胚胎进行Daw1敲低、野生型人DAW1拯救以及患者等位基因的功能检测，研究人员证明Daw1缺失会破坏左右轴模式、心脏环化和黏液纤毛流，而患者两个等位基因表现出显著不同的组织特异性功能。该研究确立了DAW1变异解读的功能标准，支持将剪接位点变异重分类为可能致病性，并将p.Arg114Gln鉴定为情境依赖性亚等位基因，同时展示了体内发育模型在纤毛病基因型–表型关系研究中的价值。
主要技术方法
研究对象为IRB HSR210285方案下招募的一个先证者及其父母的家系。研究人员对先证者进行全基因组测序，使用Genomiser/Exomiser进行候选变异优先化和ACMG/AMP分类；用MultAlin多序列比对和AlphaFold3进行结构建模。在X. tropicalis胚胎中，用翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonucleotide，MO）敲低daw1，共注射编码野生型或患者变异的MStayGold标记人DAW1 mRNA或质粒DNA进行拯救；通过pitx2原位杂交评估左右轴模式，在发育第48期评估心脏环化，用荧光微球追踪评估黏液纤毛流，用抗乙酰化微管蛋白免疫荧光和共聚焦显微镜评估纤毛定位、纤毛荧光强度及多纤毛细胞（multiciliated cells，MCCs）顶面面积。所有实验重复三次，统计采用卡方检验和Welch t检验。
研究结果
**患者临床表型**
先证者为37周+6天出生的男婴，出生后超声心动图和心脏MRI显示右心室双出口（double-outlet right ventricle，DORV）伴D-型大动脉转位、大瓣下室间隔缺损、后部肌部室间隔缺损、中型动脉导管未闭和小继发孔房间隔缺损/卵圆孔未闭。随访至2岁时，患儿无呼吸道症状、无哮喘或反应性气道疾病、无反复感染史；腹部超声正常，胸片和CT未见椎体或其他骨骼异常。结论：患者表型为复杂CHD形式的HTX/偏侧性缺陷谱，但无PCD证据。
**全基因组测序分析与候选变异**
WGS数据经Genomiser优先化后，DAW1被确定为最可能的候选基因，表型相似度评分为0.683，由先证者临床特征与原发性纤毛运动障碍52型的吻合驱动。检测到两个稀有复合杂合变异：母源遗传的剪接供体变异c.648+1 G>A（rs927376980），人群最大等位频率为1.33×10
-5，LOFTEE预测为高置信度功能缺失（loss-of-function，LOF）等位基因，SpliceAI预测剪接供体丢失评分为0.95；父源遗传的错义变异c.341 G>A（p.Arg114Gln，rs759511456），人群最大等位频率为5.13×10
-4，Phred标度CADD评分为28。二者在Exomiser ACMG/AMP分类中均为VUS，以复合杂合方式分离，符合常染色体隐性遗传。结论：DAW1复合杂合变异是解释先证者表型的最可能候选。
**计算预测与AlphaFold建模**
对于p.Arg114Gln，多个计算工具的预测不一致：Revel、SIFT、FATHMM、MetaLR和PrimateAI提示不确定或良性，而AlphaMissense、MutationAssessor、MutationTaster和DANN提示有害；AlphaFold3结构建模未显示该残基替换对蛋白结构产生可辨别影响。对于c.648+1 G>A，DANN、SpliceAI、dbscSNV Ada和dbscSNV RF均强烈预测剪接破坏，主要后果为外显子7跳跃；AlphaFold显示缺失残基181–216引起β-螺旋桨结构局部扰动，但整体架构保留。由于该框内缺失不引入提前终止密码子，预测可逃逸无义介导的mRNA降解，可能表达缺少残基181–216的截短蛋白。结论：R114Q仍属VUS，而剪接位点变异被强预测为致病性剪接破坏。
**Daw1敲低在体内影响左右轴模式与纤毛运动**
研究人员向X. tropicalis胚胎注射daw1 MO后，在第28期进行pitx2原位杂交，结果显示异常表达（右侧、双侧或缺失）比例较对照组显著升高；在第48期评估心脏环化，发现D环（正常）减少，L环和A环等异常环化显著增加；荧光微球实验显示Daw1缺失导致黏液纤毛流显著丧失；抗乙酰化微管蛋白免疫荧光显示MCC顶面面积和纤毛荧光强度均显著降低。结论：Daw1为左右轴模式、心脏环化和黏液纤毛流所必需，其缺失同时影响纤毛组装或运动。
**野生型人DAW1拯救左右轴模式与黏液纤毛流**
将C端融合MStayGold标签的野生型人DAW1（WT-hDAW1-msg）mRNA或质粒DNA与膜RFP共注射后，WT-hDAW1-msg定位于MCC的基体和纤毛轴丝。将WT-hDAW1-msg与daw1 MO共注射，可显著恢复黏液纤毛流和心脏环化的正常比例。结论：MO表型具有特异性，野生型人DAW1可功能替代X. tropicalis Daw1。
**错义突变的情境特异性拯救**
R114Q-hDAW1-msg的mRNA和质粒DNA注射均显示其定位于MCC基体和纤毛轴丝，与野生型无差异。功能实验中，R114Q-hDAW1-msg可显著改善daw1 MO导致的黏液纤毛流丧失，但未能拯救心脏环化缺陷（MO组与R114Q拯救组差异不显著，p=0.064）。结论：p.Arg114Gln保留了MCC中驱动黏液纤毛流的功能，但丧失了左右组织器（left-right organizer，LRO）纤毛中参与左右轴模式的功能，属于情境依赖性亚等位基因。
**剪接位
