《MicrobiologyOpen》：Single-Step Production of Mannitol From Yacon Fructo-Oligosaccharides Using Fructophilic Lactic Acid Bacteria
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甘露醇（Mannitol）是一种天然存在的糖醇，在食品和制药工业中具有多种应用，尤其作为一种低热量甜味剂备受关注。虽然甘露醇可以通过化学方法合成，但通过细菌发酵合成因其成本低、合成条件温和（接近环境温度）且产率高，是一种颇具吸引力的生产方式。细菌生产还使得利用
甘露醇（Mannitol）是一种天然存在的糖醇，在食品和制药工业中具有多种应用，尤其作为一种低热量甜味剂备受关注。虽然甘露醇可以通过化学方法合成，但通过细菌发酵合成因其成本低、合成条件温和（接近环境温度）且产率高，是一种颇具吸引力的生产方式。细菌生产还使得利用低成本、第二代原料以可持续方式生产甘露醇成为可能。本研究描述了利用先前从花卉来源分离的肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和果糖杆菌（Fructobacillus fructophilus）从雪莲果（Smallanthus sonchifolius）块茎生产甘露醇的可行性。该块茎含有超过50%的低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS），研究发现其无需预先水解或糖化预处理即可用于甘露醇生产。通过对多种耐果糖乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）的初步筛选，研究人员选择了最 robust 的甘露醇生产菌株用于优化培养条件和放大生产。研究人员最终在200 mL生物反应器中，使用2%雪莲果根粉和肠系膜明串珠菌成功生产了高达7 g/L的甘露醇，实现了大于0.6 g甘露醇/g FOS的产率，且随着培养规模扩大，滴度没有显著下降。该研究表明，雪莲果粉是一种适合且廉价的底物，可通过生物转化可持续且经济地生产这一重要的糖醇。最后，研究人员讨论了未来提高生产规模和纯度的途径。
一、研究背景与意义
甘露醇（Mannitol）是一种天然存在的六碳糖醇，在食品和制药工业中具有多种应用，尤其作为低热量甜味剂（欧盟批准编号E421）备受关注，其血糖生成指数和热值均较低。2024年全球甘露醇市场规模估计为4.51亿美元，预计未来5年将增长5%。目前工业上主要通过高温高压条件下化学还原转化糖生产甘露醇，但该过程会产生高达75%的山梨醇（Sorbitol）副产物，增加了下游处理的复杂性。微生物发酵生产甘露醇具有显著优势：在常压和温和温度（30°C–37°C）下进行，无需昂贵催化剂，发酵液中甘露醇回收更简单，并可使用来自食品和农业废弃物的廉价原料替代纯糖。然而，对于更复杂的原料，低聚糖通常需要独立于发酵步骤进行糖化或水解处理，这增加了工艺复杂性。因此，开发一种能够同时完成糖化和甘露醇转化的整合生物加工（consolidated bioprocessing）流程具有重要的经济意义。
二、研究内容与结论
本研究首次证明了雪莲果（Smallanthus sonchifolius）块茎中的低聚果糖（Fructooligosaccharides，FOS）可作为嗜果乳酸菌（Fructophilic Lactic Acid Bacteria，FLAB）生产甘露醇的有效底物。雪莲果是南美安第斯地区的块茎作物，其多个品种具有高FOS和抗氧化剂含量，已在爱尔兰成功种植。研究人员从花卉来源分离的肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和果糖杆菌（Fructobacillus fructosus）能够直接分解FOS为果糖并将其转化为甘露醇。当培养基中同时存在葡萄糖时，葡萄糖支持生长和一般代谢，而来源于FOS的果糖则专门用于甘露醇生产。研究筛选了10株FLAB菌株，最终选定肠系膜明串珠菌DPC 7246用于放大生产。在200 mL生物反应器中，使用2%雪莲果根粉（Yacon Root Powder，YRP），甘露醇产量达到6.7–7 g/L，产率为0.61–0.63 g甘露醇/g FOS，与文献报道的其他复杂底物（如菊粉0.58 g/g、菊苣水解物0.69 g/g、菊芋0.68 g/g）相当或更优。该研究为利用天然植物底物进行甘露醇的可持续细菌生产提供了重要第一步，同时为雪莲果这一作物增添了超出其作为主食和健康食品之外的经济价值。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：（1）菌株筛选：从DPC Culture Collection（Teagasc，Moorepark，Fermoy，爱尔兰）和DSMZ德国微生物保藏中心获取菌株，在含1%果糖的MRS培养基（FMRS）中活化培养，筛选具有甘露醇生产能力的FLAB菌株；（2）底物分析：采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）分析YRP中FOS的聚合度（DP）分布，采用高效液相色谱（HPLC）定量甘露醇、葡萄糖、果糖、乙醇、乳酸和乙酸浓度；（3）发酵条件优化：考察温度（30°C、37°C）、搅拌（有/无 agitation）和YRP添加量（1%、2%）对甘露醇生产的影响；（4）放大发酵：在250 mL台式Minibio生物反应器（200 mL工作体积）中进行放大实验，使用2% YMRS培养基（不含Tween 80），30°C或37°C、200 rpm持续搅拌、不通气、不控制pH条件下发酵48小时。
四、研究结果
3.1 雪莲果根粉的组成
雪莲果根粉（YRP）含有54.8%（w/w）的FOS，而用于制备该粉末的糖浆仅含28% FOS。粉末中还含有19.7%果糖、6.2%葡萄糖、5.25%蔗糖，游离糖总量为31.1%。HPAEC分析显示，大多数FOS的聚合度（DP）在4到6之间。YRP在水中的溶解度可达10%（w/w）。在4°C冷库中储存超过一年，游离糖组成保持稳定。高压灭菌YRP溶液不会显著改变游离糖百分比。培养基中的Tween 80（聚山梨酯）被确定会导致YRP在高压灭菌后形成絮状沉淀，因此在放大实验中使用了不含Tween的YMRS培养基。
3.2 嗜果乳酸菌从雪莲果根粉生产甘露醇
研究人员筛选了多种FLAB菌株在含1% YRP的MRS培养基（1% YMRS）中生产甘露醇的能力。所有选定的FLAB菌株在30°C、15 mL培养体积下均能产生4–5 g/L甘露醇，而两个物种的模式菌株产量低于3 g/L。果糖杆菌DPC菌株的产量是模式菌株的两倍（5.2 ± 0.48 g/L vs. 2.6 ± 0.54 g/L）。对照菌株发酵乳杆菌（Limisolactobacillus fermentum）在YMRS中产量低于3 g/L，但在FMRS（1%果糖）中20小时后产量至少达到10 g/L，表明花卉来源的FLAB分离株更适合将未经处理的FOS转化为甘露醇。值得注意的是，从YRP生产甘露醇的最佳菌株与先前报道的从果糖生产甘露醇的最佳菌株并不一致。基因组分析显示肠系膜明串珠菌DPC 7261含有两个编码GH32结构域糖苷水解酶的基因，可能为菊粉酶或转化酶，提示这些菌株能够降解YRP中的FOS。与菊粉相比，YRP在相同发酵时间内产生了显著更多的甘露醇，表明FOS作为甘露醇底物具有更高的生物可利用性。研究人员最终选择肠系膜明串珠菌DPC 7246（分离自栒子花）进行放大研究，因其在目标条件下生长更 robust 且对氧气的耐受性更宽松；果糖杆菌菌株则因絮凝现象严重而未被选用于放大。
3.3 发酵时间对甘露醇生产的影响
对最有前景的FLAB菌株在1% YMRS中进行了28小时的时间进程实验。结果显示最佳生产时间在16至20小时之间（取决于菌株），肠系膜明串珠菌DPC 7246的峰值滴度为5.1 ± 0.48 g/L，果糖杆菌DPC 7237为5.5 ± 0.58 g/L，但24小时后均出现均匀下降。由于未检测到果糖且甘露醇水平下降，推测甘露醇可能被重新转化为果糖以支持中心碳代谢或辅因子再生。
3.4 温度和搅拌对甘露醇生产的影响
研究人员在30°C和37°C、有或无搅拌条件下评估了甘露醇生产。总体上，改变搅拌条件或提高发酵温度并未显著改善甘露醇生产。对于肠系膜明串珠菌DPC 7246，所有条件下甘露醇产量下降均不超过25%；无搅拌发酵在30°C和37°C下最大滴度分别降低8%和14%。对于果糖杆菌DPC 7237，无搅拌条件下产量峰值更为尖锐。由于改变温度或搅拌没有明显优势，后续实验在30°C和温和搅拌条件下进行。
3.5 雪莲果根粉添加量对甘露醇生产的影响
将YRP增加到2%（2% YMRS）后，DPC 7246的峰值甘露醇滴度仅增加约33%，同时检测到乙醇产生。时间进程显示滴度约在32小时达到峰值，并在48小时内保持恒定或略有下降。乙醇是异型发酵乳酸菌的预期副产物，但在1% YMRS发酵中未检测到。这可能是因为部分果糖从甘露醇生产溢出，进入磷酸戊糖途径最终生成乙醇；也可能是增加的YRP代谢导致更多NADH产生，细菌利用乙醇生产来再生NAD+。同时，与1% YRP相比，2% YRP条件下乳酸产量增加而乙酸产量减少。净结果是甘露醇产率从1% YRP时的0.92 g甘露醇/g FOS降至2% YRP时的0.635 g甘露醇/g FOS。
3.6 甘露醇生产的放大
研究人员在台式生物反应器中评估了200 mL培养体积（相比15 mL放大十倍以上）的甘露醇生产。在30°C和37°C下，甘露醇产量峰值达到6.7 g/L，与较小培养体积相当，但达到最大滴度的时间更早（24–28小时 vs. 15 mL时的32小时）。从15 mL（24小时6.55 g/L）放大到200 mL（24小时6.38 g/L）时甘露醇滴度没有显著变化，但两者均高于40 mL摇瓶培养（24小时5.73 g/L），推测40 mL体积下额外通气影响了氧化还原平衡，降低了对NAD+再生的需求。37°C发酵中甘露醇滴度在20–24小时后出现波动，可能归因于该温度下甘露醇脱氢酶反应的循环；乙醇滴度较30°C低约20%，葡萄糖消耗更慢（48小时后剩余6.9 g/L vs. 30°C时的3.3 g/L）。考虑2% YRP中FOS的百分比，DPC 7246在两个温度下的峰值甘露醇产率为0.61–0.62 g甘露醇/g FOS，与15 mL培养的0.63 g/g相比，放大未显著影响生产。发酵结束时培养基pH通常在4.1至4.3之间。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究结果作为从雪莲果生产甘露醇的概念验证。未来工作需优化发酵以获得更高滴度，这需要更高的YRP浓度，并需研究具有更高果糖耐受性的菌株。由于肠系膜明串珠菌在2% YMRS中产生乙醇作为代谢副产物，未来需评估替代底物投喂策略，以确保更高量的底物有效转化为甘露醇。初步发酵显示较低YRP负载下甘露醇生产效率更高（0.92 g/g vs. 0.61 g/g），且产生的乙醇和乳酸更少；使用补料分批发酵可能在不损失生产率的情况下获得更高甘露醇产率。更高的底物负载和放大可能需要不同的培养基配方以降低成分成本并避免沉淀问题。先前研究表明胰蛋白胨和玉米浆可作为乳酸菌的替代氮源，将在未来研究中评估。
结论部分翻译：本研究首次证明了雪莲果低聚果糖是利用嗜果乳酸菌高效生产甘露醇的可行底物，产率达到0.61–0.63 g甘露醇/g FOS，与文献报道的其他复杂底物相当。同时，该研究为雪莲果块茎在其作为主食和健康食品价值之外增添了经济价值。研究人员使用含有纯天然植物基低聚果糖的雪莲果根粉作为体内酶的底物，成功地从肠系膜明串珠菌菌株在2% YRP条件下以多种规模生产甘露醇，放大过程中最大滴度6.7 g/L甘露醇无显著下降。研究菌株利用完整的雪莲果低聚果糖作为底物，而以往大多数甘露醇生产研究使用的是水解的富含果糖底物、还原糖混合物或富含还原糖的天然果汁。总之，研究结果为利用天然底物进行甘露醇细菌生产提供了重要第一步，分别证明了雪莲果低聚果糖和嗜果乳酸菌在此任务中的可行性。
