《New Plant Protection》：Impact of the GouM transporter on secondary metabolism activation and production yield in Streptomyces noursei strain CK-15
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Streptomyces noursei 可产生多种具有农业意义的生物活性次级代谢产物；然而，其生产和分泌的调控机制在很大程度上仍未得到阐明。为探究这一问题，研究人员系统地表征了 S. noursei CK-15 的次级代谢潜力，并研究了转运蛋白基因 gouM
Streptomyces noursei 可产生多种具有农业意义的生物活性次级代谢产物；然而，其生产和分泌的调控机制在很大程度上仍未得到阐明。为探究这一问题，研究人员系统地表征了 S. noursei CK-15 的次级代谢潜力，并研究了转运蛋白基因 gouM 在调控gougerotin外排及全局基因簇相互作用中的作用。PacBio 测序揭示了一条长度为 9.34 Mb 的线性基因组，包含 36 个生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）。通过遗传操作和转录组分析，研究人员证明，过表达簇内定位的转运蛋白基因 gouM 可显著增强 gougerotin 的分泌，使总产量提升至 1.97 g/L，较野生型菌株提高了 114%。相反，gouM 缺失则扰乱了中心碳代谢，并导致 gougerotin 产量下降。值得注意的是，转录组分析揭示了 BGCs 之间广泛的交叉调控：针对 gougerotin 基因簇的定向工程不仅改变了其自身的转录水平，还差异性地调控了多个已知基因簇，并成功激活了多条沉默或隐秘途径，包括参与铁载体（siderophore）、链丝菌素（streptothricin）和 bosamycin 生物合成的途径。这些发现建立了转运蛋白基因活性与代谢物外排及沉默基因簇唤醒之间的直接联系，为链霉菌中提高产物滴度和发现天然产物提供了一种新的工程策略。
**论文解读：gouM 转运蛋白在 Streptomyces noursei CK-15 次级代谢调控与产量提升中的核心作用**
**1. 研究背景与科学问题**
链霉菌（*Streptomyces*）是天然产物的主要来源，其产生的次级代谢产物在医药、农业和化工领域具有广泛应用。随着全基因组测序技术的发展，研究表明链霉菌基因组中蕴含的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）数量远超传统方法已鉴定的化合物数量，但大多数 BGCs 在实验室条件下处于转录沉默状态，其产物与功能仍属未知。激活这些沉默基因簇、揭示其产物并提高目标代谢物产量，是该领域的核心挑战。当前常用策略包括同源重组、CRISPR 基因编辑和调控基因修饰等，但针对转运蛋白在次级代谢全局调控中作用的研究仍相对有限。gougerotin 是一种具有广谱抗菌、抗肿瘤和杀螨活性的核苷-肽类抗生素，由多种链霉菌产生，其中包括 *Streptomyces noursei* strain CK-15。该菌株分离自福建武夷山土壤，其发酵液具有广谱低毒抗真菌活性，在农业生物防治中具有应用潜力。然而，调控 gougerotin 合成与外排的分子机制，以及 gougerotin 基因簇与其他 BGCs 之间的交叉调控关系，尚不清楚。因此，本研究旨在通过基因组挖掘、遗传操作和转录组分析，系统阐明 CK-15 的次级代谢潜力，并重点解析转运蛋白基因 *gouM* 在 gougerotin 外排、产量提升及全局 BGC 调控中的作用。
**2. 主要研究内容与结论**
研究人员完成了 *S. noursei* CK-15 的全基因组测序与精细注释，鉴定了 36 个次级代谢 BGCs，并通过系统发育分析确认了其分类地位。在此基础上，研究人员构建了 *gouM* 缺失突变株（Δ*gouM*）、回补株（Δ*gouM*-C）和过表达株（*gouM* OE），结合发酵产物定量、形态观察和转录组测序，系统评估了 *gouM* 对 gougerotin 分泌、孢子形成、中心碳代谢以及多个已知/沉默 BGC 转录活性的影响。研究得出以下核心结论：其一，*gouM* 过表达使 gougerotin 总产量达 1.97 g/L，较野生型提高 114%，且细胞外 gougerotin 含量显著增加，证明 *gouM* 编码的主要协助扩散转运蛋白（major facilitator superfamily，MFS）直接促进 gougerotin 外排；其二，*gouM* 缺失导致 gougerotin 合成消失，并显著抑制与 UDP-葡萄糖醛酸合成相关的中心碳代谢途径；其三，转录组分析揭示 *gouM* 的缺失或过表达可差异调控多个已知 BGC（如 nystatin、oxazolepoxidomycin、salinosporamide-like 等），并成功激活了多条沉默 BGCs（siderophore/legonoxmine、streptothricin 和 bosamycin）。上述结果为通过转运蛋白工程提高链霉菌次级代谢产物产量及挖掘新型天然产物提供了新策略。
**3. 关键技术与方法**
本研究采用的主要技术方法包括：PacBio 单分子实时（single-molecule real-time，SMRT）测序完成全基因组组装与注释；antiSMASH 软件预测次级代谢 BGCs；基于全基因组序列构建系统发育树；通过同源重组双交换构建 *gouM* 缺失突变株，利用整合型载体 pSETC 携带组成型启动子 *kasO\*p* 构建过表达菌株；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量发酵液中 gougerotin 及其他次级代谢产物；Illumina NovaSeq 6000 平台进行 RNA 测序（RNA-seq），结合 DESeq2 分析差异表达基因，并利用 KEGG 和 GO 富集分析解析代谢通路变化。样本为野生型 *S. noursei* CK-15（CGMCC No. 31251）及其衍生菌株。
**4. 主要研究结果**
**4.1 基因组特征与次级代谢潜力**
PacBio 测序组装获得一条 9,336,218 bp 的线性染色体，GC 含量为 72.35%，预测 8186 个开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中 98.28% 获得功能注释。antiSMASH 分析鉴定出 36 个 BGCs，占基因组的 22.05%，其中 23 个位于染色体末端臂区。12 个 BGCs 与已知抗生素途径（如 tetramycin、cycloheximide）的同源性超过 83%，18 个 BGCs 与已知序列的同源性低于 30%，提示具有发现新型化合物的潜力。系统发育分析表明 CK-15 与 *S. noursei* ZMP 和 NK660 亲缘关系最近（99% 序列一致性），确认其分类地位。
**4.2 发酵产物鉴定与 gouM 功能初探**
LC-MS 分析检测到 CK-15 发酵液中含有五种主要抗生素：gougerotin（758.01 mg/L）、natamycin（201.43 mg/L）、toyocamycin（79.44 mg/L）、anisomycin（107.76 mg/L）和 nystatin A1（702.24 mg/L）。以 *Streptomyces graminearus* AS4.506 中已知的 gougerotin BGC 为查询序列进行本地 BLAST，成功鉴定出 CK-15 中的同源基因簇，其中 *gouM* 编码 MFS 转运蛋白，被选为进一步遗传操作和机制研究的关键靶点。
**4.3 ΔgouM 突变体与 gouM 过表达株的构建及表型分析**
通过双交换等位替换构建 Δ*gouM* 突变株，并利用整合型质粒构建 Δ*gouM*-C 回补株和 *gouM* OE 过表达株。表型观察显示，Δ*gouM* 菌株在 SFM 培养基上孢子形成显著延迟，几乎不产生灰色孢子；*gouM* OE 菌株孢子形成最旺盛，菌落表面覆盖密集灰色孢子。牛津杯法抗真菌活性测定表明，Δ*gouM* 发酵液对指示菌 *Rhodotorula rubra* 的抑菌圈直径较野生型显著缩小，而 *gouM* OE 的抑菌圈直径显著大于野生型。
**4.4 gouM 对 gougerotin 产量和分泌的影响**
LC-MS 定量分析显示，野生型 CK-15 在发酵 72 h 后 gougerotin 产量为 930 mg/L，Δ*gouM* 突变体未检测到 gougerotin，Δ*gouM*-C 回补株产量恢复至野生型水平；*gouM* OE 菌株总产量达 1.97 g/L，较野生型提高 114%。胞内外分布分析表明，*gouM* OE 菌株胞外 gougerotin 浓度为 969.52 mg/L，显著高于野生型的 402.97 mg/L；而胞内含量（284.26 mg/L）低于野生型（355.33 mg/L）。上述结果证实 *gouM* 过表达促进了 gougerotin 从胞内向胞外的转运，进而提高了总产量。
**4.5 ΔgouM 突变体中心碳代谢的转录组变化**
KEGG 富集分析显示，Δ*gouM* 突变体与野生型相比，多个代谢通路发生显著转录变化，包括中心碳代谢、生物膜形成和蛋白质加工与转运。共鉴定出 15 个与中心碳代谢相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），大多数显著下调（log2FoldChange 为 ?1 至 ?4）。涉及 UDP-葡萄糖醛酸合成的抗坏血酸和醛酸代谢、磷酸肌醇代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径均受到显著抑制。说明 *gouM* 缺失破坏了以 UDP-葡萄糖醛酸为中心代谢枢纽，导致中心碳代谢通量受损。
**4.6 gouM 过表达对胞外区相关基因的调控**
GO 富集分析显示，*gouM* OE 与野生型之间的 1845 个 DEGs 在细胞组分层面显著富集于“胞外区”。其中，S1 家族丝氨酸肽酶基因 *SE95_RS11235* 表达下降 4 倍，而 *SE95_RS11245* 表达上升 3.2 倍，SNAP 样溶菌酶家族锌依赖性金属蛋白酶 *SE95_RS36565* 表达下降 2 倍。KEGG 通路富集分析表明，这些 DEGs 主要涉及嘌呤代谢、叶酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等途径。
**4.7 gouM 对已知生物合成基因簇的交叉调控**
转录组分析揭示，Δ*gouM* 突变体中 salinosporamide-like BGC 整体上调（I 型 PKS 基因 *SE95_RS06320* 上调 2.06 倍），oxazolepoxidomycin BGC 整体下调，toyocamycin BGC 核心 NRPS 基因 *queC* 和 *queD* 显著下降，natamycin BGC 呈异质性调控（PKS 核心模块稳定，通路特异性调控基因 *SE95_RS07180* 上调 1.91 倍），anisomycin BGC 中甲基转移酶和糖基转移酶基因下调而氨基腺苷酸化结构域蛋白和 SAM 依赖性甲基转移酶基因上调，nystatin BGC 中 I 型 PKS 基因上调 1.92–2.25 倍而硫酯酶基因下调。在 *gouM* OE 菌株中，nystatin BGC 呈现最显著的全局激活（ABC 转运蛋白基因上调 21–86 倍，关键 PKS 基因上调 134 倍），oxazolepoxidomycin 和 salinosporamide-like BGC 亦被激活，但 anisomycin、toyocamycin 和 natamycin BGC 中的部分核心基因被抑制。上述结果表明 *gouM* 的遗传操作通过跨基因簇调控网络重塑了次级代谢谱。
**4.8 沉默生物合成基因簇的激活**
Δ*gouM* 突变体中，siderophore/legonoxmine 基因簇显著上调（IucA/IucC 合成酶基因 *SE95_RS11570* 上调 41.6 倍），streptothricin 基因簇中 SbnA/SbnB 等关键酶上调 7.6–9.7 倍，bosamycin 基因簇多数基因上调 1.5–1.8 倍。在 *gouM* OE 菌株中，siderophore/legonoxmine 基因簇激活更加强烈（IucA/IucC 上调 50 倍），streptothricin 基因簇中 SbnA 和 SbnB 分别上调 43.8 和 25.0 倍，bosamycin 基因簇仅部分修饰酶发生轻微变化。上述结果证实，针对 *gouM* 的遗传操作可解除对多条隐晦 BGCs 的转录抑制，实现沉默基因簇的激活。
**5. 讨论与结论**
本研究表明，*gouM* 作为 gougerotin 基因簇内的 MFS 转运蛋白基因，不仅直接介导 gougerotin 的外排，还通过影响胞内代谢通量和全局 BGC 调控网络，间接调控多个次级代谢途径。*gouM* 过表达通过促进产物外排减轻了胞内反馈抑制，进而提高总产量；同时转录组证据显示 *gouM* 过表达可选择性激活 nystatin、oxazolepoxidomycin 和 salinosporamide-like 等 BGCs 并抑制 anisomycin 等途径，表明转运蛋白在链霉菌次级代谢全局调控中扮演重要角色。该研究建立的“转运蛋白工程”策略，为链霉菌中提高已知代谢物产量和激活沉默基因簇以发现新天然产物提供了普适性思路。
研究结论可翻译为：*S. noursei* strain CK-15 含有 36 个次级代谢 BGCs，其中 12 个与已知抗生素途径高度同源、18 个与现有数据库相似性低，表明其具有发现新化合物的强大潜力。发酵液 LC-MS 分析鉴定出 gougerotin、natamycin、toyocamycin、anisomycin 和 nystatin 五种生物活性代谢物，其中 gougerotin 产量最高。gougerotin BGC 的缺失消除了其产生并破坏了 UDP-葡萄糖醛酸依赖的中心碳代谢。Δ*gouM* 突变体的转录组分析显示 salinosporamide-like 和 nystatin 基因簇被激活，oxazolepoxidomycin 和 toyocamycin 核心途径被抑制，natamycin 和 anisomycin 基因簇受到差异调控；同时，沉默的 siderophore/legonoxmine、streptothricin 和 bosamycin 基因簇显著上调。转运蛋白基因 *gouM* 的过表达使 gougerotin 产量显著提高 114% 并增强其胞外分泌，同时增加了参与胞外蛋白质降解和底物转运的基因表达。此外，*gouM* 过表达还上调了沉默的 siderophore/desferrioxamine 和 streptothricin BGCs 的转录。这些发现凸显了转运蛋白介导的调控在提高链霉菌次级代谢产物产量和揭示隐秘生物合成途径中的关键作用。
