《New Microbes and New Infections》：Interferon gamma and inflammatory response genes by weighted gene co-expression network analysis reveal significant associations with severe dengue infection in India
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登革病毒（DENV）每年感染3.9亿人，其中9600万人出现临床或亚临床症状，约为世界卫生组织（WHO）登革热负担估计的三倍。印度约占全球登革热感染的30%，许多地区呈高度地方性流行，多种血清型全年共同传播。DENV感染导致从无症状到重症乃至危及生命的广泛临床
登革病毒（DENV）每年感染3.9亿人，其中9600万人出现临床或亚临床症状，约为世界卫生组织（WHO）登革热负担估计的三倍。印度约占全球登革热感染的30%，许多地区呈高度地方性流行，多种血清型全年共同传播。DENV感染导致从无症状到重症乃至危及生命的广泛临床谱系表现。2009年修订分类将登革热分为无警示征象（D-WS；DWS）和有警示征象（WS）及重症登革热（SD），其中“有警示征象”包括凝血异常（血小板减少症）、临床液体蓄积（血液浓缩）和血管脆性增加等表现。因此，结合临床症状与实验室临床参数的初步评估对于判断登革热感染严重程度至关重要。
人类宿主转录动态捕捉基因功能有助于理解导致登革热发病机制复杂性的细胞过程。受登革病毒感染显著影响的多条宿主通路包括抗病毒和促炎细胞因子、Toll样受体（TLR）信号、核因子κB（NF-kappa B）信号、肿瘤坏死因子（TNF）信号以及补体和凝血级联。感染DENV的内皮细胞分泌细胞因子和白介素，加剧血管通透性并触发炎症反应，导致血浆渗漏。因此，早期基因表达模式可为疾病进展和严重程度提供线索。
研究人员先前已报道了来自24例登革热患者血清样本的病原载量和宿主反应。在一个拥有14亿人口的国家，理解驱动登革热疾病严重程度的因素仍是关键需求。为此，该研究调查了来自112例登革热阳性患者全血的早期转录特征，这些患者表现为有或无警示征象。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）全面评估宿主mRNA表达模式，以基于临床参数识别改变的生物学过程及其与严重程度的关联。研究人员鉴定了与临床特征相关的共表达模块，为登革热感染期间的转录组变化提供了新见解。值得注意的是，在表现出警示征象的患者中，整个免疫格局尤其是干扰素反应和炎症与低血小板计数呈正相关，将发病机制向临床严重结局调节。
一、研究背景与目的
登革病毒（DENV）每年感染全球约3.9亿人，其中印度约占全球登革热感染的30%，多个地区呈高度地方性流行且多种血清型全年共同传播。登革热感染可导致从无症状到危及生命的广泛临床谱系，2009年WHO修订分类将其分为无警示征象（D-WS）、有警示征象（WS）和重症登革热（SD），其中“有警示征象”包括凝血异常（血小板减少症）、临床液体蓄积和血管脆性增加。尽管登革热感染在热带和亚热带地区是重大公共卫生关切，但其多因素临床表现使结局判断复杂化。宿主免疫调控涉及促病毒与抗病毒反应之间的微妙平衡，最终决定恢复或重症结局。虽然初始临床参数可为评估重症表现提供窗口，但登革热患者间的严重程度风险因素并不一致。因此，该研究旨在通过早期全血转录组分析捕捉临床参数出现紊乱时的宿主转录组细微差异，识别潜在的临床生物标志物和持续生物学过程，以促进重症病例的有效诊断和临床管理。
二、研究设计与主要技术方法
该研究为横断面研究，纳入印度新德里MAX医院报告的112例有症状登革热阳性患者，在患者首次医院就诊期间采集EDTA抗凝全血样本。基于2009年WHO登革热分类指南，91例归入“无警示征象”（-WS）类别，其中根据白细胞减少（LP）情况进一步分为-WS-LP（轻度，n=45）和-WS+LP（中度，n=46）；21例归入“有警示征象”类别并表现血小板减少（TC），被指定为WS+TC（重度）。所有样本均经NS1抗原检测确认登革热阳性，且均为初次感染。主要技术方法包括：全血RNA提取后进行Illumina TruSeq链特异性总RNA文库构建，在Illumina NextSeq 2000平台进行双端2×151读长测序；使用Salmon进行准映射定量，DESeq2进行差异基因表达分析；利用Enrichr和Reactome数据库进行功能富集分析；采用WGCNA v1.72.5对14,071个基因进行加权基因共表达网络分析，通过动态树切割识别模块，并利用Pearson相关和Spearman相关评估模块-临床特征关联及基因-特征关系。
三、主要研究结果
（一）登革热队列的临床特征
所有112例患者均处于急性发热期，平均发热天数为3.69天。血清型分析显示大多数患者感染DENV-2，与研究期间德里循环血清型一致。WS+TC组男性患者比例较高（81%），中位年龄35岁。血液学参数方面，总白细胞计数（TLC）和血小板计数在组间差异显著（p<0.001），淋巴细胞和中性粒细胞也存在显著差异（p<0.001）。两个表现白细胞减少的组（-WS+LP和WS+TC）显示低中性粒细胞和较高淋巴细胞值。肝功检查（LFT）显示WS+TC组SGOT和SGPT水平高于正常范围，总蛋白显著降低，胆红素水平显著升高，但均在正常范围内。
（二）早期全血转录特征显示WS与-WS患者的不同状态
差异基因表达分析显示，中度与轻度比较（-WS+LP vs -WS-LP）得到15个显著下调基因，主要与免疫反应（CXCL2、CCRL2、CD177、ORM1）、炎症调控（PI3）和免疫信号（HES4、DUSP13）相关，提示中度患者免疫反应受抑。重度与轻度比较（WS+TC vs -WS-LP）得到215个上调和92个下调基因，重度与中度比较（WS+TC vs -WS+LP）得到142个上调和2个下调基因。通路富集分析显示，上调通路主要涉及糖基化和神经系统过程；下调通路则涵盖免疫系统和炎症反应通路、GPCR信号、血小板激活与聚集以及前列腺素合成通路，揭示血小板功能改变和炎症介质异常。值得注意的是，尽管WS+TC患者中主要免疫反应基因下调，但B细胞受体（BCR；免疫球蛋白轻链和重链可变区）基因出现上调，显示与严重程度相关的急性抗体反应。KIR3DL3、LILRB5和IRAK1BP1的上调将先天免疫通路导向炎症消退。
（三）WGCNA分析揭示与WS和-WS组相反功能关联的模块
WGCNA分析将14,071个基因分配到22个模块中，软阈值功率为30。两个主要分支（clade）在WS+TC（重度）中呈现显著不同的共表达模式：clade 1（红色；高表达）包括MEgrey至MElightyellow模块，其中MEcyan显著富集代谢过程，MEblue与糖基化和神经系统一致，MEblack和MEmagenta涉及DNA修复机制；clade 2（蓝色；低表达）包括MEdarkred至MEpink模块，显著富集血液凝固、血小板激活、细胞黏附（MEdarkred）、免疫反应、病毒复制调控、干扰素反应、细胞因子信号（MEgreen/greenyellow/brown/red）、细胞呼吸和蛋白质降解等通路。模块-临床特征相关分析显示，clade 2模块与血小板计数显著正相关，而clade 1中仅turquoise模块与血小板计数负相关；TLC、中性粒细胞和淋巴细胞与任何模块均无显著相关；SGOT仅与clade 1中代表代谢过程的MEcyan、MElightcyan和MElightyellow模块显著负相关。
（四）模块相关关键基因的鉴定揭示受血小板调控的多样化先天免疫格局
线性回归分析鉴定出与血小板计数显著正相关的关键基因。MEgreenyellow模块包含干扰素通路相关基因IFI44L、IFI35、KAT2B、OAS1和SAMD9L；MEdarkred模块包含血小板功能/凝血和黏附相关基因ARHGEF12、CTTN、SELP、MFAP3L、PPBP、PRKAR2B和F13A1；MEbrown模块包含RNA结合蛋白基因HNRNPA2B1和RBM8A、分子伴侣DNAJB6和DNAJA1、IFIH1（编码MDA5）及TRAF3IP3等。METurquoise是唯一与血小板计数显著负相关的模块，包含ATP5MJ、CASP4、COX7B、GPD2、ISCA1和LPGAT1等线粒体功能基因，与DENV感染的缓解相关。进一步将WS+TC患者按血小板计数分为重度血小板减少组（<100×109/L）和中间组（100-140×109/L），发现16个基因的基线转录本计数（ΔCPM）存在显著差异，其中IFI44L的ΔCPM超过800，是最突出的区分基因。
四、讨论与结论
该研究发现WS+TC患者呈现受抑的先天免疫和炎症状态，细胞因子和白介素（CXCL8、CXCL16、CXCL2和IL1B）下调，这些是内皮和血管功能障碍中炎症级联的关键驱动因素。然而，研究也识别出登革热感染中内皮破坏的非炎症通路，NS1蛋白主要通过破坏内皮糖萼导致血浆渗漏。WS+TC患者中O-连接糖基化相关基因（GALNT13、B4GALT1、B3GNT4和MUC12/4）上调，提示糖基化通路可能影响内皮完整性。低血小板计数与干扰素信号、先天免疫和炎症通路的系统性免疫反应变化强烈相关，表明血小板减少在驱动疾病进展中发挥重要作用。与巴西登革热患者转录组研究的一致性支持了干扰素刺激基因（ISGs）在登革热严重程度中的核心作用，同时CTTN基因的检出补充了免疫-内皮轴，提示可能存在人群特异性因素。
研究结论指出，有警示征象患者中低血小板计数指示受抑的干扰素状态，可能支持病毒持续存在并加重感染。内皮糖萼破坏是登革热血管渗漏的中心非炎症机制，通过改变的O-糖基化通路介导，独立于炎症细胞因子。监测糖萼相关基因特征可实现重症风险患者的早期识别，而保护糖萼完整性的治疗策略可能代表减少血管并发症的新方法。糖基化通路可作为预测和减轻重症登革热相关血管渗漏的关键分子生物标志物和治疗靶点。该研究描绘了从早期免疫逃逸到血小板耗竭再到结构性血管损害的相互关联的分子级联。研究局限性在于横断面设计，仅采集急性期单时间点血样，无法评估基因表达的时序动态，未来需纵向研究以更好理解登革热发病机制的动态分子变化。
