肿瘤自身抗原构象稳定性与结构域特异性特征调控自身抗体表位倾向性

《Protein Science》：Conformational stability and domain-specific structural features of tumor autoantigens regulate autoantibody epitope propensity

　　

专业摘要翻译 针对肿瘤相关自身抗原的自身抗体是癌症诊断中具有临床价值的生物标志物，然而，决定其表位选择性的结构因素仍不清楚。本研究探讨了在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中，靶向自身抗原的内在构象稳定性是否调控肿瘤相关自身抗体的表位倾向性。研究人员采用一种双抗原Luminex微球检测方法，将每种自身抗原分别以其天然形式和S-阳离子化变性形式呈现，直接比较了11种自身抗原的IgG自身抗体对构象表位和线性表位的反应性。内在无序且易聚集的自身抗原，包括癌/睾丸抗原（cancer/testis antigens, CTAs）、NY-ESO-1和XAGE-1b，主要引发线性表位导向的免疫应答，而热力学稳定的可溶性自身抗原通常驱动构象表位识别。有趣的是，对于同时含有有序和无序片段的自身抗原，免疫应答严格受结构域特异性生物物理学特性指导：p53特异性抗体优先靶向其两侧的无序区域，而Wilms瘤蛋白1（WT-1）则例外地驱动针对其结构化锌指结构域的构象识别。所有11种自身抗原在大肠杆菌中的重组可溶性与其表位类别广泛相关，证实对于自主折叠的单体胞质蛋白而言，原核表达系统的折叠效率通常反映了其在体内的内在构象稳定性。实验可溶比率与AlphaFold3推导的Rosetta能量单位/溶剂可及表面积（REU/SASA）值之间的一致性提供了独立的计算验证，证明了热力学估计值与患者来源的免疫数据在一个统一的生物物理学框架内趋于一致。这些发现确立了自身抗体表位倾向性与靶向自身抗原的热力学稳定性密切相关，并为基于自身抗体的癌症诊断中定制抗原制备策略提供了合理依据。

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一、研究背景与目的

在正常生理条件下，机体对自身抗原的免疫耐受是防御自身免疫的关键。然而，在自身免疫性疾病和癌症中，这种稳态平衡被打破，导致产生针对自身蛋白的自身抗体。这些自身抗体被认为源于持续的炎症或抗肿瘤免疫反应，后者促使细胞内蛋白释放并激发体液免疫应答。由于自身抗体的产生需要抗原刺激B细胞，且抗原是通过抗肿瘤免疫或自身免疫反应从死亡细胞中释放的，因此外周血中自身抗体的水平反映了这些免疫反应的强度。

尽管已有多种分子机制被提出用于解释自身抗体应答的诱导，例如某些自身抗原携带病毒样序列可激活幼稚库中的自身反应性B细胞，以及基于氨基酸组成（包括亲水性、碱性、芳香性和主链柔性）的物理化学“倾向性规则”可能有利于B细胞表位的形成，但表位作图研究始终揭示出显著的个体间异质性，不同患者的自身抗体常识别不同的线性表位。更重要的是，许多自身抗原本身构象不稳定且易于聚集。癌/睾丸抗原（CTAs）在肿瘤细胞中异常表达，富含内在无序区域（IDRs），并在人细胞系中过表达时频繁聚集。同样，肿瘤相关抗原（TAAs）在肿瘤细胞中过表达或异常修饰，也表现出高聚集倾向。这些蛋白的聚集性和无序性被认为是其免疫原性和激发体液应答能力的基础。

鉴于这些自身抗原固有的结构不稳定性，增溶处理对于制备用于免疫测定的重组自身抗原至关重要。然而，癌症患者体内的自身抗体究竟优先识别类天然构象、部分折叠中间态还是完全无序的抗原状态，这一问题尚不清楚。本研究旨在通过直接比较非小细胞肺癌（NSCLC）患者中五种代表性自身抗原（以类天然构象或化学变性S-阳离子化状态呈现）的自身抗体反应性，来解答这一核心问题。这一比较框架有望为理解抗原结构紊乱如何塑造自身抗体表位选择提供新见解，并更广泛地阐明体液免疫系统识别肿瘤衍生自身蛋白的机制。

二、主要技术方法

研究人员采用多重S-阳离子化抗原固定化Luminex微球（MUSCAT）检测法，该方法利用光谱编码的磁珠同时呈现天然构象抗原和S-阳离子化变性抗原，实现了对构象与线性表位倾向性的直接对比。为了获得天然构象完整的抗原，研究人员将自身抗原作为谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白在低温条件下表达，并通过链霉亲和素层析纯化。对于变性抗原，则使用6 M盐酸胍（GdnHCl）变性后，经三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原和3-溴-N,N,N-三甲基丙烷-1-溴化铵（TAP-Br）进行半胱氨酸特异性S-阳离子化修饰，再经反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。此外，研究人员还利用AlphaFold3预测蛋白质结构，并通过Rosetta松弛协议和溶剂可及表面积（SASA）计算，获得了归一化的Rosetta能量单位（REU/SASA）作为热力学稳定性的计算代理指标。血浆样本来源于日本冈山大学医院Okadai生物银行提供的NSCLC患者样本。

三、研究结果

2.1 用于表位倾向性分析的自身抗体生物标志物的选择

研究人员从MUSCAT检测面板（包含130种自身抗原）中筛选出NSCLC患者中升高的五种自身抗体生物标志物。这些自身抗体最初因与固定在微球上的S-阳离子化变性抗原反应而被归类为具有线性表位偏好。相应的自身抗原在大肠杆菌中以不溶性包涵体（IBs）形式表达，随后通过半胱氨酸特异性S-阳离子化增溶。此外，还选择了六种优先结合天然抗原构象的自身抗体作为构象表位候选。为了直接比较，将这六种天然抗原变性后进行S-阳离子化处理，得到S-阳离子化变性抗原。最终，每种自身抗原的两种形式（天然构象和S-阳离子化线性化形式）被固定在不同光谱编码的Luminex微球上，实现了单次多重检测中同时评估自身抗体对构象和线性表位的反应性。

2.2 IgG自身抗体结合的表位倾向性比较分析

研究人员系统地比较了四种识别线性表位的自身抗体对GST融合抗原（呈现构象表位）的结合倾向性。结果显示，CTA家族成员NY-ESO-1和XAGE-1b对线性表位的反应性显著更高，这与它们富含IDRs的结构特征一致。相比之下，靶向WT-1的自身抗体对构象表位表现出更高的反应性。尽管WT-1蛋白整体预测含有大量无序区域，但其C端锌指结构域形成了约30%-35%的有序三级结构，这些结构域在体内可能维持局部热力学稳定性，从而作为B细胞受体的稳健构象模板。对于p53，全长p53的自身抗体反应性在变性和天然形式之间相当，表明大多数p53特异性自身抗体识别的是线性表位。进一步分析发现，针对分离的p53 DNA结合结构域（DBD）的自身抗体对变性形式也表现出同等反应性，这支持了p53自身抗体主要靶向其两侧无序区域的结论。

2.3 通过破坏构象表位进行自身抗体表位分析

为了进一步表征自身抗体结合的表位倾向性，研究人员将那些在细菌中表达后保持稳定天然构象的自身抗原进行S-阳离子化处理以破坏其构象。通过Luminex微球检测直接比较了自身抗体对天然构象抗原和相应S-阳离子化变性抗原的反应性。所有六种抗原均显示出对构象表位的明显偏好，表现为S-阳离子化变性后自身抗体结合减少。然而，大部分自身抗体反应性在天然和变性形式中均有保留，表明相应的自身抗体识别的线性表位在两种构象状态下均可及。

2.4 自身抗原结构稳定性与表位倾向性之间的相关性

研究人员假设，对于无需二硫键、膜整合和翻译后修饰即可自主折叠的单体胞质蛋白，其在大肠杆菌中的重组蛋白可溶性可作为体内固有结构稳定性的可靠代理指标。通过比较11种自身抗原的实验可溶性比率（可溶/不可溶部分）与计算得出的REU/SASA值，发现了统计学上显著的相关性：形成包涵体的自身抗原具有较低的REU/SASA值，而可溶性抗原则具有较高的值。将线性/构象表位结合比率（L/C比率）对REU/SASA作图，揭示了两个离散的聚类：形成包涵体且构象稳定性较低的自身抗原表现出优先的线性表位识别（L/C比率中位数：3.41），而可溶性且构象稳定性较高的自身抗原则主要引发构象表位识别（L/C比率中位数：0.52）。

四、讨论与结论

本研究证明，靶向自身抗原的固有结构稳定性是肿瘤相关自身抗体表位倾向性的主要决定因素。热力学稳定的可溶性自身抗原优先驱动构象表位识别，而易于聚集或被蛋白酶降解的蛋白则倾向于线性表位应答。患者来源的免疫数据与AlphaFold3衍生的REU/SASA估计值之间的一致性证实，这些表位倾向性根植于控制蛋白质折叠和稳定性的基本生物物理学原理。

对于在体内自主折叠的单体胞质自身抗原，在大肠杆菌中37°C下作为重组蛋白表达，为其在肿瘤微环境中的内在构象稳定性提供了一个简便的实验代理指标。这种结构不稳定性可部分归因于CTAs和TAAs的异位和异常表达。CTAs通常局限于免疫豁免的生殖细胞，但在癌细胞中，基因组失调导致其在缺乏同源结合伴侣的情况下重新激活。类似地，TAAs的过表达超出了其正确组装所需的化学计量平衡。因此，当细胞被细胞免疫反应裂解，这些蛋白泄漏到B细胞免疫反应部位时，它们无法采用生物活性构象，从而促进聚集或蛋白水解降解。

p53的案例特别具有启发性。尽管p53含有一个结构化的DBD，但数据显示p53特异性自身抗体对天然和变性形式的结合能力相同，这表明免疫应答主要指向p53两侧的无序区域。这可能反映了一个更广泛的原理：即使在含有有序结构域的自身抗原中，体液免疫应答也优先采样那些持续可供B细胞受体结合的无序溶剂暴露区域。相比之下，WT-1表现出独特的结构域特异性免疫原性。尽管其N端广泛无序导致在大肠杆菌中形成不溶性组分，但人体免疫系统却优先识别其C端锌指结构域的构象表位。这种差异表明，自身抗体表位倾向性受到结构域特异性结构特征和局部构象稳定性的精细调控。

这些发现对设计自身抗体检测平台具有重要的实际意义。准确的生物标志物测量需要以保留靶向抗体识别结构基序的形式呈现抗原。仅依赖天然构象的检测会系统性低估占主导地位的抗体库，而变性检测则可能破坏结构稳定自身抗原的主要表位。因此，抗原制备策略必须根据每种靶抗原的生物物理学特性进行定制。本研究中使用的MUSCAT检测法，利用化学性质稳定的水溶性S-阳离子化抗原，特别适用于捕获靶向无序CTAs和富含IDR的TAAs的自身抗体。

总之，自身抗原的结构完整性是其免疫学特征的主要决定因素。观察到的可溶性、计算机模拟REU计算以及患者来源的表位谱分析三者趋于一致，建立了一个稳健的生物物理学框架：因异位表达或过表达而本质无序的自身抗原优先引发线性表位导向的抗体，而结构稳定的蛋白则倾向于构象应答。这些见解阐明了抗肿瘤体液免疫的调控机制，并为优化抗原呈递策略以开发灵敏的基于自身抗体的癌症诊断工具提供了理性的循证基础。