《Protein Science》：The lower γ region supports forward rotation in the latter half of the 80° substep of F1-ATPase
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F1-ATP酶（F1-ATPase）通过α?β?环的协同构象循环实现其γ轴的单向旋转，然而轴-环相互作用如何决定旋转方向性仍不清楚。本研究将单分子旋转分析（single-molecule rotation assay）与催化条件下的冷冻电镜（cryo-EM）结
F1-ATP酶（F1-ATPase）通过α?β?环的协同构象循环实现其γ轴的单向旋转，然而轴-环相互作用如何决定旋转方向性仍不清楚。本研究将单分子旋转分析（single-molecule rotation assay）与催化条件下的冷冻电镜（cryo-EM）结构分析相结合，对γ下部区域被截断的无轴突变体TF1（axle-less TF1）进行了研究。在ATP饱和条件下，野生型TF1每转呈现三次与催化驻留态（catalytic dwell）对应的暂停，而无轴突变体TF1则呈现六次，揭示了一个可能由γ截断所稳定化的额外中间驻留态。该驻留态出现在结合驻留态（binding dwell）与催化驻留态之间40°的位置。高速记录显示，在中间驻留态与催化驻留态之间的40°过渡区间内存在频繁的后退步。驻留时间分析表明，这两个状态之间的自由能偏置近似为零，与检测不到方向性偏置的结果一致。冷冻电镜解析了相应的结合、中间及催化驻留态结构，显示从0°到40°存在主要的β构象变化，但40°到80°之间β重排极小，提示该段旋转并未与大尺度的β构象转变相耦合。因此，无轴突变体TF1中的0-80°子步包含两个区段：伴随β构象重大变化的、有方向性的0-40°运动，以及几乎无可检测β重排且方向性偏置显著降低的40-80°间隔。这些发现表明，在无轴突变体TF1中，80°子步的后半段通过热扩散进行且无方向性偏置，而下部γ区域在正常情况下可能有助于将该间隔偏置为前向旋转。
**论文解读：下部γ区域在F1-ATPase 80°子步后半段前向旋转中的作用**
**一、研究背景与科学问题**
FoF1-ATP合酶是维持细胞能量系统的核心酶之一，广泛存在于原核生物质膜、叶绿体类囊体膜和线粒体内膜。F1部分作为独立的ATP水解驱动旋转马达，其最小功能组成单元为α?β?γ：中心γ亚基相对于α?β?定子环旋转。在催化过程中，三个β亚基协同发生与催化循环偶联的构象转变，产生旋转扭矩推动γ亚基单向转动。单分子旋转分析已建立了较为完善的化学机械偶联方案：每120°单元步进一步细分为ATP结合触发的80°子步和ATP裂解伴随的40°子步。然而，扭矩产生与传递的分子机制仍未完全阐明。结构研究鉴定出三个主要的β-γ相互作用位点——疏水套筒、β-catch环和β-lever结构域——沿γ轴从N端方向排列。早期定点突变未发现单独关键残基；Kinosita研究组的大规模截断分析表明，即使缺失大部分γ轴、仅保留与β-lever结构域的最小接触，突变体仍能维持单向旋转，但速度与扭矩显著降低。Furlong等（2025）解析了γ亚基N端4个和C端25个残基缺失的γΔN4C25突变体在AMPPNP条件下的冷冻电镜结构，确认了缺乏下部γ轴的结合驻留态仍可形成，但γ轴截断如何影响后续旋转子步及方向性偏置尚不清楚。本研究旨在系统考察γ轴截断对F1旋转行为的影响，重点关注单个子步及化学机械偶联中旋转中间态的变化。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员利用此前Kinosita研究组开发的γΔN4C25突变体（本文称axle-less TF1），结合单分子旋转分析与催化条件下的冷冻电镜结构分析，鉴定出一个位于结合驻留态与催化驻留态之间约40°处的新驻留态（new dwell），并揭示了该驻留态与催化驻留态之间近乎等能的特征。高时间分辨率记录显示，催化驻留态向新驻留态的后退步频繁发生，表明40-80°间隔缺乏方向性偏置。结构分析显示，0-40°运动伴随β亚基的显著构象变化，而40-80°间隔几乎没有可检测的β构象重排，提示该段运动通过热扩散进行。该结果表明，下部γ区域在正常F1中起到将这一间隔偏置为前向旋转的作用。
**三、关键技术与方法**
研究人员使用来自嗜热菌Bacillus PS3的TF1（野生型及γΔN4C25突变体，后者质粒来自S. Furuike，蛋白样品来自Furlong等（2025）纯化并保存的批次），通过以下方法开展研究：（1）单分子旋转分析：以40-nm金胶体为探针，激光暗场显微镜观察，高速相机以500-30,000帧/秒（fps）记录旋转，采用缓冲液交换实验、ATPγS类似物实验、变点分析和驻留时间指数拟合等方法分析旋转动力学与后退步；（2）冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）：在ATP底物条件下快速冷冻样品，Titan Krios 300 kV电镜收集数据，cryoSPARC v4.4.1进行图像处理、三维分类与精修，Coot、Isolde和PHENIX完成模型构建。
**四、研究结果**
**2.1 无轴TF1的构建与验证**：研究人员将γΔN4C25截断突变引入野生型TF1表达载体（含His标签和用于旋转测定的两个半胱氨酸残基），经凝胶过滤色谱纯化。SDS-PAGE确认γ亚基按设计缩短，但γ条带强度低于野生型，提示部分复合物缺失γ亚基。
**2.2 旋转动力学与步进行为**：axle-less TF1最大旋转速率Vmax为11 rps，约为野生型180 rps的十分之一；Km为7.1 μM，约为野生型24 μM的三分之一；ATP结合速率常数kon约为野生型的五分之一。在ATP饱和条件下，axle-less TF1呈现六个暂停（~80°/40°子步），表明存在额外中间驻留态；在接近Km浓度时呈现九个暂停（~40°子步）。研究人员还观察到axle-less TF1在旋转中频繁出现后退步。
**2.3 结合驻留态角位置的鉴定**：通过低/高[ATP]缓冲液交换实验，研究人员确认三个ATP依赖的暂停为结合驻留态，并结合驻留态到下一个驻留态的角差直方图中心为41°±6°。
**2.4 催化驻留态角位置的鉴定**：使用缓慢水解类似物ATPγS延长催化驻留态的暂停期，选择性延长了~40°子步之后的暂停。由此确认催化驻留态位于结合驻留态前方约80°处，而新驻留态（green箭头）位于两者之间，即结合驻留态后约40°、催化驻留态前约40°处。
**2.5 后退步分析**：30,000 fps记录显示，主要后退事件是从催化驻留态到40°后方新驻留态的后退步（717次），前向80°步仅154次。新驻留态和催化驻留态的驻留时间常数分别为4.7 ms和3.9 ms，据此估算两状态间自由能差小于kT，表明40°间隔为无方向性偏置的热扩散过程。
**2.6 结构分析**：冷冻电镜在ATP条件下解析了三个驻留态结构（分辨率2.5-2.6 ?）。γ亚基旋转角度测定为：结合驻留态到新驻留态36°，新驻留态到催化驻留态42°，与旋转测定结果一致。β亚基构象比较显示，新驻留态与催化驻留态的β构象高度相似（均为CCO状态），而结合驻留态到新驻留态存在从开放/闭合/半开放到闭合/闭合/开放的明显β构象变化。新驻留态中还鉴定出βE379–γM29、αE391–γQ22等可能的新相互作用。催化驻留态中γ亚基出现7.5°倾斜，全长γ若以刚性方式插入将产生空间冲突。
**2.7 无轴TF1的旋转反应方案**：综合旋转测定与结构分析，研究人员提出axle-less TF1的旋转反应方案：结合驻留态与催化驻留态位置与野生型一致，新驻留态位于两者之间约40°处，其ATP结合位点尚未达到催化胜任状态（ATP*），ATP裂解发生在催化驻留态。
**五、讨论与结论**
研究人员将axle-less TF1置于野生型TF1（全长γ）与无转子TF1（完全缺失γ）之间的中间系统进行考察，提出上部γ区域促进β亚基从半开放向开放构象转变，增强α?β?环的固有协同性。与先前Furlong等（2025）仅解析出结合驻留态的差异，归因于AMPPNP可能未能完全抑制axle-less TF1旋转，余留ATP污染驱动马达进入ATP结合限制状态。本研究的局限包括未直接测量扭矩，以及当前分辨率可能无法分辨新驻留态与催化驻留态之间细微的局域构象差异。研究结论可翻译为：这些发现表明，在无轴突变体TF1中，80°子步的后半段通过热扩散进行而无方向性偏置，且下部γ区域在正常情况下可能帮助将该间隔偏置为前向旋转。
