《Applied Microbiology and Biotechnology》：Fermentation-based oxalic acid production aimed at sustainable critical metal recovery from electronic waste
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本研究系统探讨了通过深层发酵进行草酸（OA, H?C?O?）的生物合成，旨在建立一种可持续的关键金属回收试剂。初步摇瓶实验评估了黑曲霉（*Aspergillus niger*）菌株（ATCC 1015 和 CECT 2807）、最佳碳源及pH调节的影响。尽管各
本研究系统探讨了通过深层发酵进行草酸（OA, H?C?O?）的生物合成，旨在建立一种可持续的关键金属回收试剂。初步摇瓶实验评估了黑曲霉（*Aspergillus niger*）菌株（ATCC 1015 和 CECT 2807）、最佳碳源及pH调节的影响。尽管各重复实验间存在固有生物变异，*A. niger* ATCC 1015表现出优越的产酸轨迹，5天内草酸产量达71.0 ± 27.7 mM。间歇性将pH调节至4.0以上显著促进分泌，产量提高至90.4 ± 5.8 mM，同时葡萄糖被确定为最佳碳源（YP/S ≈ 0.4 g/g）。基于这些初步发现，研究人员在10 L搅拌釜式生物反应器中进行了工艺强化。转向采用脉冲补料和连续pH控制的补料分批策略，有效促进了更高草酸滴度的实现，在14天内达到峰值草酸滴度260.1 ± 4.8 mM。葡萄糖酸的产生和产酸抑制构成了提高产品收率的挑战。综上所述，这些发现确立了一种稳健、可扩展的可持续草酸生成生物工艺，直接支持其作为高选择性浸出剂在电子废弃物关键金属回收中的新兴应用。
# 基于发酵的草酸生产及其在电子废弃物关键金属回收中的应用研究解读
## 研究背景与问题提出
草酸（Oxalic acid, OA, H?C?O?）作为一种重要的二元羧酸，广泛应用于制药、农业、纺织、皮革、化工及食品等工业领域。自1776年Scheele首次通过硝酸氧化糖类合成草酸以来，工业上主要依赖石油化工路线生产草酸，如丙烯氧化、乙烯氧化及草酸二烷基酯工艺。然而，传统化学合成路线依赖化石原料，伴随挥发性中间产物及显著的二氧化碳排放，不符合绿色化学原则。尽管草酸在金属浸出中展现良好的配位性能，但Choi等人的研究指出，基于全生命周期评估，草酸因其较高的大鼠半数致死剂量（LD50）未能满足绿色化学品分类标准，其环境负担根植于石油基生产路径。
欧洲联盟提出2030年气候中立目标，推动从化石原料转向可持续替代品的需求迫切。同时，电子废弃物（e-waste）危机日益严峻，智能手机、发光二极管（LED）、平板电脑等设备所需镓（Ga）、稀土元素（REE）等关键金属的长期供应面临风险。传统湿法回收采用盐酸（HCl）和硫酸（H?SO?）等无机强酸，虽有效但环境足迹高。草酸作为二元羧酸，可通过络合溶解作用与三价金属（如Al(III)、Fe(III)、Ga(III)）形成稳定的八面体配位化合物，并可作为二价金属离子（如REE）的选择性沉淀剂。已有研究表明，草酸在优化条件下可从废弃矿物中回收37%的镓，从废弃SMD-LED中回收率可达90.36%。因此，采用生物发酵途径生产草酸，既能替代石化路线，又能为电子废弃物金属回收提供可持续的浸出剂，具有战略意义。
当前关于黑曲霉（*Aspergillus niger*）产草酸的研究虽有一定积累，但缺乏系统性的工艺整合框架。以往研究多聚焦于柠檬酸发酵中抑制草酸副产物，而针对草酸作为目标产物的发酵优化研究分散且参数各异。此外，菌株选择、pH调控、碳源类型、发酵模式及放大效应之间的相互作用尚未被综合阐明。因此，本研究以黑曲霉为细胞工厂，系统地开展草酸深层发酵研究，从菌株筛选、pH调节、碳源优化到10 L规模的工艺强化，旨在建立工业化可行的生物草酸生产工艺，为电子废弃物中关键金属的高效回收提供稳定、可持续的生物浸出剂。
## 研究主要方法与技术
研究人员采用以下关键技术路线开展研究：
（1）菌株筛选与培养：选用黑曲霉ATCC 1015（购自LGC标准品）和CECT 2807（瓦伦西亚大学菌种库）两株菌株，于土豆葡萄糖琼脂（PDA）平板上定期继代培养（5-7天）以制备孢子接种物，孢子浓度通过改进型Neubauer血球计数板调整至摇瓶实验10?–10?孢子/mL，发酵罐实验10?孢子/mL。
（2）摇瓶发酵优化：采用适应自Bosshard等人的营养培养基（含葡萄糖30 g/L、NaNO? 1.5 g/L、KH?PO? 0.5 g/L、MgSO?·7H?O等），补充100 mM磷酸盐缓冲，初始pH调至6.0 ± 0.2。实验包括菌株比较、pH直接调节（间歇式NaOH调节至6.0）、碳源对比（葡萄糖、蔗糖、乳糖，各30 g/L），每种条件设三组生物学重复（n=3），通过真空过滤获得无细胞上清液。
（3）10 L生物反应器工艺强化：采用Biostat-C（Sartorius AG，德国哥廷根）生物反应器，工作体积10 L，高径比1:3，配备三组六弯叶Rushton涡轮搅拌器，环形气体分布器，集成控制系统实时监测温度、通气量、溶解氧（DO）和pH。灭菌后添加0.2 v/v% Pluronic F68消泡剂，接种后以3 N NaOH维持pH 6 ± 0.2。对比了批式模式（初始葡萄糖150 g/L）与补料分批模式（初始30 g/L，每72小时脉冲补充300 g/L葡萄糖浓缩液至总糖150 g/L）两种操作。
（4）分析检测方法：采用二硝基水杨酸（DNS）比色法测定残糖；采用毛细管电泳仪（Capel-105M，Lumex Instruments，加拿大）全自动分析草酸、葡萄糖酸、柠檬酸及常见阴离子浓度，利用标准品线性回归定量，所有测量三次重复（95%置信区间）。
## 研究结果
### 两株菌株的生物草酸生产能力比较
在240小时的摇瓶批式发酵中，ATCC 1015菌株表现出显著更高的平均草酸分泌量。初始24小时内两菌株均无明显产酸差异，但ATCC 1015在72小时时呈现快速产酸趋势，pH降至3.8 ± 0.7，而CECT 2807同期pH为4.5 ± 0.2。最终于240小时达到峰值71.0 ± 27.7 mM，而CECT 2807仅达37.9 ± 7.1 mM。该菌株间的差异与文献报道一致，且ATCC 1015的产酸潜力已被其他研究证实可高达155 mM（7天）。然而，ATCC 1015的生物学重复间标准差较大（±27.7 mM），反映了丝状真菌发酵中孢子萌发、菌丝团形态、供氧梯度的固有异质性。
### pH调控对草酸分泌的促进作用
在摇瓶培养中实施间歇性pH调节（在培养第1、4、7天调整至6.0 ± 0.2）显著影响草酸产量。pH调节组在168小时后出现约7倍的产酸激增，最终240小时滴度达90.4 ± 5.8 mM；而未调节pH的对照组pH始终低于4.0，草酸产量仅61.7 ± 1.6 mM。这一结果直接验证了草酰乙酸水解酶（OAH）在pH > 4时发挥催化活性的机制，表明维持培养体系pH高于4并非仅有益，而是实现最大产酸量的必要条件。
### 碳源对草酸发酵效率的影响
以葡萄糖、蔗糖、乳糖（各30 g/L）为碳源比较时，葡萄糖作为底物产生的草酸滴度最高达136.9 ± 69.4 mM，产品底物得率YP/S为0.4 g/g。蔗糖发酵获得82.8 ± 55.0 mM（YP/S ≈ 0.25），乳糖效果最差，72小时峰值仅72.1 ± 14.6 mM后呈下降趋势。葡萄糖可直接进入糖酵解途径，为草酸前体草酰乙酸提供高效的碳通量，而蔗糖和乳糖需要额外的酶解步骤，导致代谢通量分流，因而产酸效率显著降低。
### 10 L规模下的工艺强化：批式与补料分批模式对比
在10 L生物反应器中，批式操作呈现明显延迟：初始滞后约72小时，草酸分泌缓慢，直至312小时后残糖降到约20 g/L时才进入加速产酸期，最终384小时滴度155.2 mM，对应体积产物生成速率rP为0.036 g·L?1·h?1。补料分批操作采用每72小时脉冲补糖策略，有效缩短了滞后阶段（约28–30小时），产酸呈周期性递增。至144小时（第二个脉冲周期）滴度已达约100 mM，对应rP约0.06 g·L?1·h?1。最终在312–384小时的指数生产期后，葡萄糖消耗趋平，rP停滞，表明生产期结束。补料分批策略最终获得草酸滴度260.1 ± 4.8 mM、理论收率0.194 g/g、r0.061 g·L?1·h?1，显著优于批式操作。
## 讨论与结论
讨论部分强调了菌株选择、pH控制、碳源策略和发酵模式间的相互依赖关系。菌株比较再次证实草酸产生具有菌株依赖性，而ATCC 1015的变异大源于丝状真菌培养中的形态学异质性，建议采用更可控的搅动或颗粒强化策略稳定菌丝体形态以确保工业批次一致性。碳源实验表明，葡萄糖在代谢通量上优于二糖。pH研究进一步证明了pH > 4是草酰乙酸水解酶活性的基本条件，但0.1 M磷酸盐缓冲系统虽缓解了酸抑制，却同时促进了生物量生长，推迟了酸生成启动，直到磷酸盐消耗殆尽才进入酸性合成阶段。此外，维持pH ≈ 6也刺激了葡萄糖氧化酶（GOD）活性，导致葡萄糖酸大量共产生（384小时为226.1 ± 8.6 mM），增加了下游分离的复杂性，未来需探索替代缓冲体系以平衡这两个效应。关于放大比较，补料分批模式通过脉冲补糖将残糖维持在抑制阈值20 g/L以下，避免碳分解代谢产物抑制，保持持续指数产酸。批式模式高初始糖浓度（150 g/L）导致渗透压和粘度增高，抑制产酸。与文献报道的体积生产率相比，本研究数值较低，这归因于参数差异、操作模式、反应器构型和菌株固有代谢差异。但从摇瓶到10 L放大，补料分批策略实现了成功的工艺转移，显著提高了产率。
研究结论明确：补料分批操作结合脉冲补糖和pH > 4的稳健控制，成功以ATCC 1015菌株获得高度一致的草酸滴度260.1 ± 4.8 mM。虽然体积产酸速率低于专业文献基准，但本研究旨在建立简化、稳健且适合直接整合至工业关键金属回收的工艺框架，避免复杂且高成本的专门系统，为电子废弃物提供可靠的生物浸出剂供应，满足镓等关键金属回收的真实工业应用需求。
