基于MGB探针PCR的肺炎支原体23S rRNA基因大环内酯类耐药突变快速检测方法的建立与评价

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Endpoint genotyping of A2063G and A2064G mutations in Mycoplasma pneumoniae

　　

摘要

肺炎支原体的大环内酯类耐药性主要与23S rRNA基因V结构域的定点突变有关，最常见的是A2063G和A2064G突变。快速检测这些突变对于选择合适的抗菌治疗方案具有重要意义。本研究开发了一种基于小沟结合（MGB）探针PCR的荧光终点基因分型检测方法，用于检测肺炎支原体23S rRNA基因2063位和2064位的突变。我们设计了位点特异性MGB探针，使其能够选择性结合2063位和2064位的突变序列，从而准确区分相邻核苷酸位点的定点突变。为实现清晰的基因型特异性荧光分离，我们优化了检测条件。各基因型的检测限分别为：野生型31.0 copies/mL，A2063G型27.2 copies/mL，A2063C型43.2 copies/mL，A2063T型39.3 copies/mL，A2064G型32.7 copies/mL。在24种非目标呼吸道病原体中未观察到交叉反应。对44例疑似肺炎支原体感染患者的44份呼吸道标本进行了临床评价。Sanger测序对其中40份标本获得了可解读的结果，所开发的检测方法与所有40份序列参考结果完全一致。在全部44份标本中，与市售实时PCR检测方法相比，总体一致率为100%（44/44，95% CI，92.0–100.0%；Cohen's κ = 1.00）。总之，该多重MGB探针PCR检测方法能够快速、可靠地检测肺炎支原体中紧密相邻的大环内酯类耐药突变，可为临床中的抗菌药物决策提供及时支持。

要点

• 小沟结合剂聚合酶链反应可检测大环内酯类耐药性。

• 降低引物浓度可提高探针与靶标的区分度。

• 基因型判定可通过终点荧光完成，无需熔解曲线分析。