埃塞俄比亚中西部鸡马立克病暴发调查：病毒分离与分子检测研究

《Veterinary Medicine International》：Outbreak Investigation of Marek’s Disease in Chickens in Central and Western Ethiopia

　　

中文翻译（摘要部分） 背景 马立克病（Marek's Disease，MD）是一种造成重大经济损失的家禽疾病，可导致大量牲畜损失并推高整体健康管理成本。此前在埃塞俄比亚中西部部分地区，尚未有关于散养管理模式下的本地品种鸡中马立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）的分离及分子检测研究。 方法 本研究于2021年9月至2022年10月开展，旨在对埃塞俄比亚中西部鸡群中疑似暴发病例的MDV进行分离和分子检测。研究人员共从四个地区（即Mako、Guto Gida、Holeta和Sebeta Subcity）的临床疑似病鸡中采集了94份混合样本。样本同时来自集约化养殖系统和散养系统，但仅从散养系统中获得未接种MDV疫苗的鸡只。 结果 基于实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）检测临床样本，75份（79.78%；75/94）样本检测出病毒meq基因阳性。其中，36.17%（34/94）的阳性样本来自羽毛（34/41），其余43.62%（41/94）来自剖检组织样本（41/53）。在79.78%（75/94）的总体检出率中，Holeta镇检出率最高（95.65%），其次为Mako区（88.89%）、Sebeta Subcity（62.5%）和Guto Gida区（57.89%）。尽管存在疫苗接种状态等混杂因素，外来品种鸡的实时PCR阳性率显著更高（p = 0.04）。在10份混合肝脏样本中，所有样本（100%）经实时PCR检测均为病毒阳性。同样，所有检测器官均呈完全阳性：肾脏（10/10，100%）和脾脏（10/10，100%）。然而，在6份腺胃混合样本中，仅1份（1/6，16.67%）样本为病毒阳性，而来自临床病鸡的34份（82.9%）混合羽毛毛囊样本为MDV1阳性。在总共75份实时PCR阳性样本中，接种至DF-1细胞进行病毒分离后，45份（60%）在传至第三代时能够在细胞系上产生细胞病变效应（cytopathic effects，CPEs）。7份（40%）羽毛样本在传至第三代时仍保持阴性。 结论 本研究为埃塞俄比亚中西部鸡群中MDV的分离和分子检测提供了重要见解，凸显了该病对家禽健康和生产力的重大影响。为有效防控该病，有必要对病毒进行详细的遗传学表征，并区分外来品种中疫苗株与自然感染株。此外，还需开展实验研究，以评估本地和外来家禽品种对MDV易感性的差异。

论文解读

一、研究背景与意义

家禽养殖在埃塞俄比亚等发展中国家的经济中发挥着重要作用，是该国农业部门的重要组成部分，为食品生产和家庭粮食安全作出贡献。为此，埃塞俄比亚农业部制定了国家计划，重点发展小型和商业规模的家禽企业，以增加肉蛋产量并保障粮食安全。然而，各类家禽疾病的流行对该行业构成了重大挑战。在影响鸡的病毒性疾病中，马立克病（MD）是最具经济重要性的疾病之一，在庭院养殖和商业化家禽养殖场中均可造成显著的发病率和死亡率。

MD是一种高度致癌、淋巴增生性和神经病性的禽类病毒性疾病，由于产蛋量下降和胴体废弃，严重影响了鸡生产部门。在易感鸡群中，该病可导致易感鸟类大规模死亡，并因整体健康管理成本上升而造成重大经济损失。该病通过外来品种引入埃塞俄比亚，现已成为家禽养殖系统日益关注的问题。此前在埃塞俄比亚中部一家商业化家禽养殖场开展的MD暴发研究报告死亡率为46%，本地鸡品种中也发现了类似比率，表明MD即使在本地品种中也有致死性。

尽管MD对家禽业构成严重挑战，但埃塞俄比亚对此病现状的研究，特别是分子特征方面的研究十分有限。迄今为止在埃塞俄比亚开展的大多数研究都集中在集约化管理鸡群上，尚未有研究专门针对埃塞俄比亚中西部奥罗米亚部分地区散养管理且未接种疫苗的本地品种鸡中MD的分子现状。因此，本研究旨在调查暴发情况，并在埃塞俄比亚中西部对集约化管理的外来品种鸡和散养管理的本地品种鸡中分离和分子检测马立克病病毒（MDV）。

二、研究设计与技术方法

本研究为基于暴发病例的研究，于2021年9月至2022年10月在MD暴发地区开展，包括Buno Bedelle的Mako、West Shewa的Holeta、Sheger City的Sebeta Subcity以及East Wollega Zone的Guto Gida区。研究对象为集约化和散养两种生产系统下受MD暴发影响的鸡只，纳入表现出抑郁、体重下降、失明和部分腿部麻痹等MD临床症状的鸡。共从38只表现出疾病迹象的鸡中采集94份混合样本，包括41份混合羽毛样本和53份混合组织样本。散养管理的本地品种鸡无MDV疫苗接种史，而集约化管理系统下的鸡已接种MDV疫苗。

样本采集依据世界动物卫生组织（OIE）推荐指南进行。实验室检测方面，研究人员采用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA，使用Applied Biosystems 7500 Fast实时PCR热循环仪，针对MDV特异性meq基因进行实时荧光定量PCR检测。对于实时PCR阳性样本，接种至DF-1细胞（源自East Lansing Line（ELL-0）胚胎成纤维细胞的鸡成纤维细胞系）进行病毒分离和传代培养，逐日通过倒置显微镜观察细胞病变效应（CPEs），连续传代三次。统计分析使用R软件4.0.3版本，采用Fisher精确检验分析各变量与结果之间的关联，p值≤0.05视为具有统计学显著性。

三、研究结果

3.1 田间临床检查

实地调查显示，受影响的鸡只表现出失明、腿部和翅膀麻痹以及明显食欲减退等MD提示性症状。剖检病死鸡时，研究人员发现坐骨神经肿胀，肝脏、肾脏、心脏、腺胃和脾脏等多个器官出现特征性白色斑点或肿瘤样生长物。这些发现与MD的典型病理特征一致，表明病毒主要影响外周神经系统，并可在多个器官形成实体肿瘤。

3.2 实时荧光定量PCR检测

在94份混合样本中，75份（79.78%）检测出MDV1血清型meq基因阳性，其中36.17%来自羽毛毛囊，43.62%来自剖检组织样本。在38只被检鸡中，29只（76.31%）实时PCR阳性。品种间比较显示，15只本地品种鸡中8只（53.3%）阳性，而23只外来品种鸡中21只（91.3%）阳性，差异具有统计学显著性（Fisher = 9.01，p = 0.04）。地区间比较中，Holeta检出率最高（95.65%），其次为Mako区（88.89%）、Sebeta Subcity（62.5%），Guto Gida区最低（57.89%），地区间差异显著（p < 0.05）。不同样本类型中，肝脏、肾脏和脾脏样本均100%阳性，坐骨神经75%阳性，羽毛毛囊82.9%阳性，心脏44.44%阳性，而腺胃样本阳性率仅为16.67%。

3.3 MDV病毒分离

将75份实时PCR阳性样本接种至DF-1细胞后，45份（60%）在传至第三代时表现出典型的MDV细胞病变效应，最初表现为小圆形细胞，随后发展为小斑块形成，病灶从培养瓶表面脱落，第三代时还观察到明亮且增大的细胞。其余30份（40%）样本经三次盲传后仍无CPE，被判定为阴性。

四、讨论与结论

本研究中MDV的总体检出率与Abdel等人（77.6%）、Lopez-Osorio等人（70%）和Rahman等人（70%）的报道相近，但高于Abbas和Mehdi、Bayata等人及Duguma等人报告的7.09%至62.86%的范围，低于Davidson和Borenshtain、Yilmaz等人、Mirtneh等人、Demeke等人及Aman等人报告的80%至100%的范围。这些差异可能归因于管理实践、生态条件、样本量和样本类型的差异，以及海拔差异。

品种分析显示外来品种的实时PCR阳性率显著高于本地品种，但研究人员指出应谨慎解读这一差异，因为品种比较可能受到疫苗接种状态、管理实践和环境条件等混杂因素的影响。不同研究地区间MDV基因检出率的显著差异可能归因于不同的管理实践和鸡群密度，密集饲养的鸡群疾病传播风险更高。在剖检组织中，肝脏、肾脏和脾脏检出率最高，而腺胃最低，这可能反映了MDV1的组织嗜性，与该病的病理生理学一致——淋巴增生性病变和病毒复制主要发生在免疫活性高的内脏器官中。

病毒分离方面，60%的实时PCR阳性样本在DF-1细胞上表现出CPE，证实了部分病例中存在活跃的病毒复制。未表现出CPE的样本可能归因于DF-1细胞对不同MDV株的易感性差异、样本条件或抑制物质干扰了体外病毒复制等因素。

研究结论：本研究为埃塞俄比亚中西部鸡群中MDV的分离和分子检测提供了重要见解，揭示了该病对该地区家禽健康和生产力造成的严重影响。临床疑似病例中MDV的总体高检出率及地区间显著差异，凸显了采取地区特异性干预措施的必要性，包括改进管理实践、有针对性的疫苗接种计划和加强监测，以有效控制MDV的传播。在DF-1细胞上进行的病毒分离在大多数样本中显示出CPE，确认了部分病例中存在活跃的病毒复制。对病毒进行详细的遗传学表征并区分外来品种中疫苗株与自然感染株，对于有效防控至关重要。此外，还需进一步的实验研究来评估本地和外来家禽品种对MDV易感性的差异。