《Veterinary Medicine International》：Age-Associated Alterations in Sperm Quality and DNA Integrity in Cryopreserved Bali Bulls (Bos javanicus) Semen
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年龄相关的种公牛繁殖变化可能影响精液质量和人工授精（AI）项目的长期效率。然而，衰老的分子指标，特别是在热带本土牛种如巴厘牛（*Bos javanicus*）中，仍未得到充分表征。本研究旨在评估巴厘公牛年龄相关的解冻后精子运动学、DNA完整性、鱼精蛋白完整
年龄相关的种公牛繁殖变化可能影响精液质量和人工授精（AI）项目的长期效率。然而，衰老的分子指标，特别是在热带本土牛种如巴厘牛（*Bos javanicus*）中，仍未得到充分表征。本研究旨在评估巴厘公牛年龄相关的解冻后精子运动学、DNA完整性、鱼精蛋白完整性及睾酮浓度变化。研究人员将来自10头公牛的冻存精液分为两个年龄组（<8岁和>10岁；每组n=5）。采用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子活力参数，使用精子-牛-Halomax试剂盒评估DNA完整性，采用色霉素A3染色评估鱼精蛋白完整性，并使用ELISA测定睾酮浓度。总活力和前向活力在<8岁和>10岁组之间无显著差异（p > 0.05）。然而，>10岁公牛表现出显著更高的VSL、DCL和BCF值，而精子DNA完整性显著降低。值得注意的是，老年公牛（91.97 ± 1.32%）的DNA完整性较年轻公牛（97.82 ± 0.48%；p = 0.01）显著降低，而鱼精蛋白完整性和睾酮浓度未见显著的年龄相关差异。相关性分析显示，年轻公牛中前向活力与DNA完整性呈强正相关（r = 0.84），而老年公牛中前向活力与睾酮浓度呈强负相关（r = ?0.91）。这些研究结果表明，巴厘公牛生殖衰老主要反映为基因组完整性受损，而非常规精液质量或内分泌状态的改变。尽管<8岁和>10岁公牛之间的总活力、前向活力、鱼精蛋白完整性和睾酮浓度无显著差异，但>10岁公牛的精子DNA完整性显著低于<8岁公牛。这些发现提示，精子DNA完整性可能比常规精液特征更能作为生殖衰老的敏感生物标志物，并可能提高AI项目中种公畜繁殖力评估的准确性。
## 论文解读文章
### 研究背景与科学问题
巴厘牛（*Bos javanicus*）是印度尼西亚最重要的本土遗传资源之一，通过人工授精（AI）项目为全国牛肉生产作出重要贡献。在AI中心，遗传优良的种公牛常被使用超过10年，因此全面理解年龄相关的繁殖变化至关重要。在多种家畜物种中，高龄虽可能维持可接受的精液产量和田间生育力，但衰老与精子功能能力和分子完整性的细微改变相关。巴厘牛在热带生产系统中具有战略重要性，评估衰老对精液质量的影响对于确保持续的繁殖效率和遗传进展十分必要。
家畜衰老以精子发生的进行性改变为特征，包括氧化应激增加、线粒体功能障碍和累积性DNA损伤。牛科物种中，常规精液参数如活力和浓度在管理良好的种公牛中并不总是随年龄显著下降。除精子DNA完整性外，生殖衰老可能影响雄性生育力相关的多个生理过程。睾酮是精子发生、附睾精子成熟和正常生殖功能维持的关键调节因子，年龄相关的雄激素产生变化可能影响精液质量。分子水平上，精子和精浆蛋白表达与组成的变化与氧化应激、染色质重塑和衰老过程中的精子功能损害相关。因此，将内分泌、运动学和分子生物标志物与常规精液评估相结合，可为种公牛生殖衰老和生育潜力的评估提供更全面的方案。DNA碎片化升高与牛受精成功率降低、胚胎发育受损和妊娠率下降相关，凸显基因组稳定性在繁殖力评估中的重要性。
冷冻保存作为AI项目的基石，通过渗透压变化、膜相变和活性氧（ROS）产生对精子施加额外应激。这些过程可能加剧分子水平上预先存在的年龄相关脆弱性，潜在影响染色质完整性和解冻后功能。虽然AI中心常规评估解冻后活力，但同时对衰老公牛中DNA完整性、染色质包装和内分泌状态进行考察的研究较少，特别是在巴厘牛中。此外，睾酮浓度与解冻后精液质量的关系仍未完全阐明，因为尽管睾丸内存在细胞或基因组改变，全身雄激素水平可能保持稳定。基于上述背景，本研究旨在整合功能性（活力）、分子（DNA和染色质完整性）和内分泌参数，确定巴厘牛生殖衰老主要反映在常规精液特征还是基因组水平。
### 研究设计与技术方法
本研究于2025年11月至2026年2月期间开展。冷冻精液和血液样本取自地区人工授精中心（RAIC），该中心的巴厘公牛在标准化管理条件下饲养。研究中使用的冷冻精液为RAIC生产的商用冷冻精液，所有精液均在同一采集期内使用人工阴道采集，以尽量减少季节变异，并使用相同稀释液（AndroMed，Minitüb，德国）冷冻保存。为确保一致性，所有公牛均在相同的环境条件、饲喂方案和处理操作下饲养。研究共使用来自10头巴厘公牛的100支冷冻精液 straws（每头10支），用于评估精子活力、DNA完整性、鱼精蛋白完整性和扫描电子显微镜（SEM）观察。公牛按实际年龄分为两组：年轻组（6–8岁，n=5）和年老组（10–12岁，n=5）。
主要技术方法包括：计算机辅助精子分析（CASA）系统用于客观定量评估精子运动学参数；精子-牛-Halomax试剂盒（基于精子染色质扩散（SCD）法）用于评估DNA完整性；色霉素A3（CMA3）染色用于评估鱼精蛋白完整性；牛睾酮酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒用于测定血浆睾酮浓度；场发射扫描电子显微镜（FESEM）用于观察精子表面形态。统计分析使用SPSS 25.0，采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，Levene检验评估方差齐性，独立t检验比较年龄组间均值，Pearson相关检验评估参数间的相关性，并使用RStudio将相关矩阵可视化为热图。
### 研究结果
#### 3.1 解冻后精子活力和运动学参数
CASA分析显示年龄影响巴厘公牛冷冻-解冻精子的若干运动特征。总活力在年龄组间具有可比性（<8岁：52.20 ± 3.90% vs. >10岁：55.72 ± 4.49%；p = 0.87），但特定速度相关参数存在差异。>10岁组的精子DCL值显著高于<8岁组（45.80 ± 4.65 vs. 40.68 ± 2.41 μm/s；p = 0.02）。直线速度（VSL）也呈现类似模式，>10岁组（54.79 ± 10.68 μm/s）显著高于<8岁组（45.54 ± 4.58 μm/s；p = 0.01）。>10岁组的鞭打频率（BCF）也显著增加（25.75 ± 4.30 vs. 23.27 ± 2.13 Hz；p = 0.02）。曲线速度（VCL）在>10岁公牛中倾向于更高（110.43 ± 17.78 vs. 94.45 ± 8.47 μm/s），接近统计学显著阈值（p = 0.05）。其他CASA参数包括DAP、DSL、VAP及轨迹相关参数STR、LIN、WOB和ALH在两组间均无显著差异（p > 0.05）。该结果表明，巴厘公牛衰老并未均匀地恶化解冻后精子活力，而是诱导了速度相关运动学属性的选择性改变。
#### 3.2 精子DNA完整性与鱼精蛋白状态
解冻后精液质量评估显示，精子DNA完整性是年龄组间唯一显著差异的参数。<8岁公牛具有显著更高比例DNA完整的精子（97.82 ± 0.48% vs. 91.97 ± 1.32%；p = 0.01）。相比之下，前向活力在两组间具有可比性（<8岁组：37.02 ± 5.32%；>10岁组：46.32 ± 4.67%；p = 0.70），观察到的数值差异未达到统计显著水平。同样，鱼精蛋白完整性未表现出显著年龄相关变化，<8岁公牛正常染色质包装的精子比例为95.97 ± 1.02%，>10岁公牛为93.76 ± 2.69%（p = 0.23）。这些发现表明，虽然后精子活力和染色质包装得以维持，但>10岁公牛的精子DNA完整性下降。
#### 3.3 睾酮浓度
<8岁公牛的平均睾酮浓度为33.31 ± 22.48 ng/mL，>10岁公牛为36.00 ± 27.29 ng/mL，两组间无显著差异（p = 0.65）。两组均观察到显著的个体间变异，表现为较大的标准差和重叠的分布范围。结果表明，在所评估的巴厘公牛中，睾酮浓度未受年龄的显著影响。
#### 3.4 精液质量参数与睾酮浓度之间的相关性分析
在<8岁公牛中（图3A），前向精子活力与DNA完整性呈非常强的正相关（r = 0.84，p = 0.075），表明精子活力的改善倾向于与更好的DNA完整性相关，尽管该关系未达到统计学显著水平。相反，在>10岁公牛中（图3B），前向精子活力与睾酮浓度呈非常强的负相关（r = ?0.91，p = 0.031），表明存在统计学显著的逆相关关系。在<8岁组中，前向活力与DNA完整性强烈正相关（r = 0.84）。相反，在>10岁组中，前向活力与睾酮浓度呈强负相关（r = ?0.91），而与其他参数的关联较弱或不存在。这一相关模式的转变提示，随着衰老，活力与基因组稳定性之间发生了解耦，可能反映了老年动物中内分泌-精子功能相互作用的改变。
### 讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，衰老选择性影响了巴厘公牛解冻后精子运动学特征，而总活力在统计学上保持可比。速度相关参数（VSL、DCL、BCF）在老年公牛中显著升高，这与当代研究强调CASA来源的速度指标（尤其是VSL和VCL）比单独的总活力更能预测受精能力相一致。线粒体ATP产生效率和轴丝微管功能完整性是这些参数的基础，二者可能经历年龄相关的代谢重编程。因此，老年公牛中观察到的速度升高可能代表适应性代谢调整而非功能能力下降。BCF升高进一步支持鞭毛调节随年龄改变的观点，牵涉细胞内钙流、膜脂质组成和ATP可用性的变化。
DNA完整性是年龄组间唯一显著差异的参数，老年公牛DNA完整精子比例下降约6%，这在生物学上具有重要意义，因为即使DNA碎片化的中等程度增加也与牛胚胎发育和妊娠率降低相关。冷冻保存本身已知会加剧氧化损伤和染色质去稳定化，可能放大微小的年龄相关脆弱性。有趣的是，鱼精蛋白完整性在年龄组间保持稳定，表明大规模鱼精蛋白缺陷并非老年公牛DNA损伤增加的主要驱动因素。DNA碎片化可在鱼精蛋白含量无可测量变化的情况下独立增加，特别是在损伤源于氧化性链断裂而非精子发生过程中染色质重塑缺陷时。
睾酮浓度未显示显著年龄差异，与牛衰老生殖中全身雄激素水平不一定下降的证据一致。重要的是，睾酮稳定性与老年公牛DNA完整性降低形成对比，表明基因组恶化可能在可检测的激素功能不全之外独立发生。相关性分析揭示了年龄依赖性差异：年轻公牛中前向活力与DNA完整性密切耦合，而老年公牛中前向活力与睾酮浓度呈负相关，支持生殖衰老过程中内分泌、功能性和分子决定因素之间生物关系重组的概念。
研究结论表明，巴厘牛的衰老主要降低了精子DNA完整性，而活力和睾酮水平保持稳定。这突显了在常规精液评估中纳入精子DNA检测以提高公牛选择准确性的重要性。该研究受限于相对较小的样本量（每组5头公牛），代表研究期间AI中心可获得的全部巴厘公牛群体，未来需要在多个AI中心开展更大规模的研究以验证和扩展这些发现。
