《Plant Stress》：QTL-seq identifies genomic regions and candidate genes for tiller angle and thermo-inducible leaf colour in barley mutant-derived doubled haploid populations
编辑推荐：
分蘖角度和热诱导叶色是大麦中具有农艺重要性的性状，然而其遗传基础仍知之甚少。本研究将QTL-seq技术应用于两个双单倍体（doubled haploid, DH）群体，这两个群体来源于优良大麦品种Vlamingh的γ射线诱导突变体（V-V-HD和V-V-Y）与
分蘖角度和热诱导叶色是大麦中具有农艺重要性的性状，然而其遗传基础仍知之甚少。本研究将QTL-seq技术应用于两个双单倍体（doubled haploid, DH）群体，这两个群体来源于优良大麦品种Vlamingh的γ射线诱导突变体（V-V-HD和V-V-Y）与澳大利亚麦芽大麦品种Buloke的杂交。V-V-HD突变体在营养生长期表现匍匐生长习性，孕穗期后转为直立生长；而V-V-Y突变体表现热诱导叶绿素缺乏。研究人员对具有对比表型的混池进行全基因组重测序，并结合ΔSNP指数（ΔSNP index）分析，在4H、3H和7H染色体上鉴定到与分蘖角度相关的基因组区域。4H染色体区域内的多个候选基因与染色质调控、细胞稳态和发育信号传导相关，而3H染色体区域包含一个F-box家族蛋白及其他参与调控过程的候选基因。对于热诱导叶色，在4H染色体上鉴定到一个主效基因组区域，并在5H染色体上鉴定到一个次级基因组区域。4H染色体区域内的叶色候选基因包括携带预测高影响变异（high-impact variants）的泛素-蛋白酶体组分、编码DnaJ、DnaK/Hsp70、BAG家族伴侣调节因子6（BAG family chaperone regulator 6）的伴侣相关候选基因、一个热激转录因子以及一个SR剪接因子（SR splicing factor），其中多个基因表现出热响应表达。5H染色体区域包含在GAMETE EXPRESSED 2蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶7和5-核苷酸酶等基因中经交叉验证的错义或调控变异。研究人员针对叶色相关的4H区域开发了8个KASP标记（Kompetitive Allele-Specific PCR markers），其中7个在所选DH系中与对比表型表现出一致性。总体而言，本研究鉴定到与分蘖角度和热诱导叶色相关的基因组区域及优先候选基因，并提供了可用于进一步验证和大麦改良的性状连锁标记。
**研究背景与科学问题**
大麦（*Hordeum vulgare* L.）是全球种植最广泛的谷类作物之一，年种植面积约4404.5万公顷，年产量约1.42亿吨。澳大利亚是全球第二大啤酒大麦生产国，年产量约1327万吨。在大麦育种中，株型结构改良和逆境适应性的提升是核心目标。分蘖角度是决定冠层结构的重要农艺性状，影响光截获、杂草竞争力和适宜种植密度；部分大麦基因型在营养生长期表现匍匐生长，生殖期转为直立，这种发育转换具有重要的田间适应性意义。叶色是反映叶绿体发育、色素生物合成和光合效率的关键生理性状，温度敏感型叶色突变体为研究叶绿体蛋白稳态和热胁迫响应提供了理想材料。在水稻中，*TAC1*、*PROG1*、*LAZY1*和*TAC3*等基因已被证实调控分蘖角度和向地性；在小麦中也已克隆多个分蘖角度QTL。然而，大麦中关于分蘖角度可塑性和热诱导叶色的遗传基础仍不清楚。此前虽有一项基于标记作图的分蘖角度QTL报道（位于3H染色体）和*vvy*位点的初步定位（位于4H染色体），但缺乏高分辨率测序策略下的全基因组解析和候选基因鉴定。QTL-seq技术结合了混池分离分析（bulked segregant analysis）与全基因组重测序，能够快速、经济地鉴定性状关联基因组区域。本研究旨在利用两个大麦突变体来源的双单倍体（DH）群体，通过QTL-seq策略解析分蘖角度和热诱导叶色的遗传架构，并开发性状连锁分子标记。
**研究内容与总体设计**
研究人员利用两个已建立的DH群体开展研究：第一个群体由γ射线诱导突变体V-V-HD（营养期匍匐、孕穗后直立）与澳大利亚麦芽大麦品种Buloke（持续直立）杂交而来，用于分蘖角度研究；第二个群体由热诱导叶绿素缺乏突变体V-V-Y与Buloke杂交而来，用于热诱导叶色研究。两个突变体均来源于优良品种Vlamingh的辐照群体。此前的遗传分析显示，V-V-HD×Buloke群体中77/208个DH系表现匍匐、112个直立、19个中间型，支持主效位点控制；V-V-Y×Buloke群体中100/203个DH系表现热诱导黄叶、103个绿色，符合1:1分离，支持单基因（*vvy*）遗传。在此基础上，研究人员对每个性状选取15个极端表型个体构建对比混池，结合亲本进行全基因组重测序与QTL-seq分析。
**主要关键技术方法**
研究人员采用QTL-seq技术体系：从各极端表型DH系（每性状各15个）提取DNA并等量混合构建表型混池；利用DNBseq-T7平台进行150 bp双端全基因组重测序，测序深度为24.3×–29.6×；序列比对至大麦Morex v3参考基因组，经严格质控后获得22,740,801个高置信双等位SNP。QTL-seq分析限定于亲本间对比等位基因的高置信多态性SNP，分别以Buloke和突变亲本作为参考亲本进行双向ΔSNP指数计算，采用1 Mb滑动窗口（50 kb步长）进行平滑，以95%和99%模拟显著性阈值界定候选区间，仅保留双向分析均支持的基因组区域。候选基因功能注释采用SnpEff；表达分析利用两个已发表的公共RNA-seq数据集（PRJNA812745和PRJNA324116）评估热响应表达。最后针对4H叶色区域开发8个KASP标记并在20个对比DH系中验证。
**研究结果**
**突变表型的遗传分离**：此前研究已确认两个突变表型各受一个主效位点控制。V-V-HD×Buloke群体中77个匍匐、112个直立和19个中间型/模糊表型；V-V-Y×Buloke群体中100个黄叶与103个绿叶，符合1:1分离比，证实*vvy*位点的单基因遗传。
**双单倍体群体中的表型多样性**：亲本对比显示V-V-HD营养期匍匐生长、分蘖展开，Buloke持续直立；V-V-Y在高温田间条件下灌浆期出现叶绿素缺乏，而野生型祖先Vlamingh和Buloke维持正常绿叶。两个DH群体均出现清晰的性状分离。
**全基因组重测序和变异鉴定**：共产生54.9亿条原始读段，各样本平均测序深度24.3×–29.6×，约99%读段通过质控，98.6%成功比对至Morex v3参考基因组。经严格过滤获得22,740,801个SNP，其中97.1%位于基因间区，2.9%为基因关联变异（含161,913个错义变异、4,772个终止获得变异和9,635个剪接区变异），确保了全基因组范围的标记密度。
**分蘖角度相关基因组区域与候选基因鉴定**：通过双向亲本参考的ΔSNP指数分析，在4H染色体64.8–69.3 Mb区域鉴定到主效信号，该区间含2,966个交叉验证SNP（36个基因关联变异，分布于17个基因），优先候选基因包括转录共抑制因子SEUSS、赖氨酸特异性去甲基化酶3A-B、F-box家族蛋白、过氧化物酶体生物发生蛋白22和线粒体转录终止因子样蛋白等。3H染色体586.2–586.95 Mb区域鉴定到次级信号，含F-box家族蛋白（p.Arg340Pro）、跨膜蛋白45B（p.Thr241Ala）、激酶家族蛋白和SAGA复合体相关转录调控因子等候选基因。7H染色体585.45–586.45 Mb区域亦检测到交叉验证信号，其中含一个编码多效药物抗性蛋白13的错义变异（p.Asn36Ile）。
**热诱导叶色相关基因组区域与候选基因鉴定**：在4H染色体604.1–609.3 Mb区域鉴定到主效信号（与*vvy*位点重叠，坐标差异源于基因组组装版本重组），该区间含3,705个交叉验证SNP（771个基因关联变异，分布于131个基因）。高影响变异包括锌指MYM型蛋白5的终止获得变异（p.Ser124*）、F-box相关泛素化效应因子（p.Trp62*）、多聚泛素的剪接供体变异和酪氨酸脱羧酶的终止丢失变异。该区域还包含分子伴侣DnaJ（p.Thr231Ile）和DnaK（最大|ΔSNP指数|=0.96）、热激转录因子（p.Val209Leu）、BAG家族伴侣调节因子6（p.Thr538Ala）、叶绿体呼吸还原31（CRR31，p.Ser42Pro）、冷调控蛋白27（COR27，p.Ile148Asn）、精氨酸/丝氨酸丰富剪接因子、THO复合物亚基1及新生多肽相关复合物亚基β等。5H染色体440.25–441.40 Mb区域鉴定到次级信号，含GAMETE EXPRESSED 2蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶7和5-核苷酸酶的错义或调控变异。
**候选基因表达分析**：基于两个独立大麦RNA-seq数据集，DnaK/Hsp70和BAG6在热胁迫下均表现强烈诱导；DnaJ呈稳定基础表达并伴轻微热诱导（48小时1.7倍）；SR剪接因子在48小时出现延迟性热响应上调（约3.6倍）；COR27和WD重复蛋白在24和48小时被热诱导；THO复合物亚基1在热胁迫下瞬时下调后部分恢复；CRR31、酪氨酸脱羧酶等基因在热胁迫下表达极低或不可检测。
**KASP标记开发与评价**：针对4H叶色候选区域（604.1–609.3 Mb）开发了8个KASP标记，其中7个产生清晰可评分的基因型分型结果，并在20个对比DH系中与叶色表型表现出高度一致性——特定等位基因始终与绿叶表型关联，替代等位基因富集于黄叶表型；一个标记（snpHV00272）未产生可靠分型信号。
**讨论与结论**
本研究的讨论部分指出，QTL-seq分析中采用双参考亲本策略有效提高了区域推断的稳健性；由于DH群体包含突变体与Buloke间的自然多态性，所鉴定的信号应视为表型关联区域而非直接指认γ射线诱导的因果突变。4H分蘖角度区域内的SEUSS共抑制因子、赖氨酸去甲基化酶和F-box蛋白等候选基因提示转录、表观遗传和蛋白调控机制可能参与分蘖朝向调控；3H区域信号与既往精细定位的V-V-HD位点不重叠，代表新增的表型关联区域，且该区间落入大麦meta-QTL MQTL3H-11内。4H叶色区域富含泛素-蛋白酶体组分、DnaJ-DnaK-BAG伴侣系统和热激转录因子，与热胁迫下蛋白质稳态维持的生物学功能高度吻合；该区域与报道的*vvy*位点和MQTL4H-13区间重叠，4个GWAS标记位于重叠区段。表达分析支持DnaK和BAG6作为热胁迫响应的核心组分。7个KASP标记与表型的一致性为4H区域的初步验证提供了依据，但需在更大群体和多样种质中进一步确认标记的稳健性和诊断准确性。研究结论指出，本研究证明QTL-seq结合双向亲本参考分析能够有效鉴定大麦农艺性状关联基因组区域；共鉴定到分蘖角度相关区域（4H、3H、7H）和热诱导叶色相关区域（4H、5H），其中4H叶色区域包含热响应蛋白稳态、叶绿体功能和转录后调控相关优先候选基因，7个KASP标记与对比表型一致，为后续功能基因组学和大麦育种研究提供了有价值的基因组资源与分子标记。
