猕猴桃U-box E3泛素连接酶基因家族全基因组鉴定及AdUbox79在盐胁迫下的功能表征

《Plant Stress》：Genome-wide identification of the U-box E3 ubiquitin ligase family in kiwifruit and functional characterization of AdUbox79 under salinity stress

　　

盐胁迫显著限制了猕猴桃（Actinidia deliciosa cv. Hayward）等作物的生产力。U-box E3泛素连接酶在非生物胁迫过程中的翻译后调控中起着关键作用；然而，猕猴桃中的AdUbox基因家族在很大程度上仍未得到表征。本研究在美味猕猴桃基因组中鉴定出88个AdUbox基因，这些基因被分为八个系统发育不同的组，具有多样的结构和理化性质。其中，研究人员选择了AdUbox79进行功能表征。其表达在盐胁迫和渗透胁迫处理后48小时的根中被显著诱导，并且AdUbox79:eGFP融合蛋白特异性定位于质膜。在烟草（Nicotiana tabacum）中异源过表达AdUbox79赋予了对盐胁迫的敏感性，表现为叶面积、主根长度、鲜重和植株生长减少。转基因株系表现出较低的相对含水量和叶绿素含量，同时叶片黄化和活性氧（ROS）积累增加。生理学分析显示，AdUbox79过表达损害了气孔动力学，表现为尽管气孔密度较低，但气孔关闭能力下降。此外，在转基因株系中，ABA依赖性和ABA非依赖性通路中关键的盐胁迫响应基因的表达均受到显著抑制。总之，这些结果表明，在烟草中AdUbox79作为盐胁迫响应的负调控因子发挥作用，为猕猴桃中泛素介导的调控网络提供了新的见解。

研究背景与科学问题

全球气候变化模型预测，气候模式的改变将直接影响降雨的频率和强度，并升高温度和大气CO₂水平，这将加剧干旱和耕地盐渍化导致的荒漠化，特别是在干旱和半干旱地区。土壤盐渍化是限制作物生产的主要胁迫之一，进而威胁全球粮食安全，据估计，由于过度施肥、淋溶和排水不良，33%的灌溉耕地受到盐渍化的影响。土壤盐度升高会导致细胞内Na⁺过量，影响细胞稳态和关键的生理过程，如水势降低、细胞脱水、水力阻力和离子失衡。这些又会引发一系列副作用，如细胞扩张和代谢活动减少、气孔关闭、光合作用抑制、碳固定改变、ROS产生增加、膜失稳、蛋白质变性以及生长发育减缓。植物适应不利环境条件的能力在很大程度上取决于由多种生化、生理和分子机制调控的定量反应，包括离子稳态与Na⁺区室化、渗透保护剂的生物合成以及抗氧化化合物和酶的积累、耐受基因的表达。其中，SOS（Salt Overly Sensitive）通路中的SOS3、SOS2和SOS1基因参与离子稳态，负责将Na⁺从细胞质输出到细胞外空间。另一个重要的盐胁迫耐受途径是由脱落酸（ABA）介导的，它调控诸如NCED、SnRK2和AREB等基因的表达。此外，植物还存在一种ABA非依赖性响应机制，通过脱水响应元件结合（DREB）转录因子和参与缓解ROS过量产生的Osmotin蛋白来实现。

另一种重要的盐胁迫耐受调控方式是翻译后水平的调控，即通过控制关键蛋白的稳定性和功能来维持细胞蛋白质稳态以应对内源性因素和环境胁迫。其主要机制是通过26S蛋白酶体对蛋白质进行泛素化和降解，涉及三个关键酶：E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶。E3连接酶在识别靶蛋白进行泛素化以及随后通过26S蛋白酶体降解中起着关键作用。U-box E3连接酶包含一个约70个氨基酸残基的结构域，形成类似于RING结构域的三级结构，但缺乏结合锌离子的氨基酸残基。先前在许多植物物种中的研究已经确定，U-box E3连接酶调节对非生物胁迫的反应，可作为正调控因子（促进耐受性）或负调控因子（诱导易感性）。例如，拟南芥中的AtPUB11、AtPUB19、AtPUB22、AtPUB23、AtPUB30和AtPUB41被报道为非生物胁迫的负调控因子。然而，美味猕猴桃cv. Hayward中U-box E3泛素连接酶基因家族及其对盐胁迫的响应尚不清楚。美味猕猴桃cv. Hayward是一种六倍体物种，因其高含量的抗氧化剂、维生素C、纤维、酚类和类胡萝卜素而在预防致癌和心血管疾病方面具有有益品质。但它对热、冷、涝渍、干旱和盐度等非生物胁迫敏感，这会影响其营养发育、叶面积和光合速率。因此，本研究的目的是鉴定美味猕猴桃cv. Hayward基因组中的U-box E3泛素连接酶基因家族，并通过在烟草中过表达来功能评估其中一个基因对盐胁迫的响应。

主要技术方法

研究人员采用隐马尔可夫模型（HMM）从美味猕猴桃cv. Hayward基因组中初步鉴定U-box基因，并使用Pfam、SMART和InterProScan数据库交叉验证以确保结构完整性。利用MEME Suite平台鉴定保守基序。通过ClustalW进行多序列比对，并在MEGA11中使用最大似然法构建系统发育树。利用STRING数据库进行基因本体（GO）富集分析。通过qRT-PCR检测AdUbox79在盐胁迫（200 mM NaCl）和干旱胁迫（200 mM甘露醇）处理下根组织中的表达模式。通过农杆菌介导的转化法在烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）中异源过表达AdUbox79，并进行亚细胞定位观察。对转基因T1和T2代株系进行了体外和离体盐胁迫表型分析，包括ROS检测、生理参数测定及盐胁迫响应基因表达分析。

研究结果

3.1. 美味猕猴桃cv. Hayward基因组中U-box基因的鉴定：共鉴定出88个AdUbox基因，命名为AdUbox1至AdUbox88，分布于27条染色体上。基因长度从1001 bp到22263 bp不等，含1到29个外显子，编码143到1964个氨基酸的蛋白质。大部分AdUbox蛋白为亲水性不稳定性蛋白。

3.2. 结构域鉴定、系统发育分析和GO富集：所有88个候选蛋白均含有完整的U-box结构域，并鉴定出多种共存的功能域，如UFD2、ARM、STYKc、TPR、WD40等。基于与64个拟南芥U-box蛋白的系统发育分析，88个AdUbox成员被分为八个不同的簇。GO富集分析表明AdUbox蛋白主要参与蛋白质泛素化和大分子代谢过程。

3.3. 基于生物信息学分析的AdUbox79选择：通过同源比对，筛选出与已知负调控因子AtPUB11高度同源的AdUbox79，其氨基酸一致性为44.12%，且在根中具有特异性表达谱。AdUbox79蛋白包含UND、U-box和五个串联ARM结构域，其三维结构预测显示U-box结构域呈典型的ββαβα折叠。

3.4. AdUbox79表达受盐胁迫和干旱胁迫诱导：在盐胁迫（200 mM NaCl）和干旱胁迫（200 mM甘露醇）处理下，AdUbox79在根中的表达均在48小时显著上调。

3.5. AdUbox79蛋白的亚细胞定位：通过在本氏烟叶片中的瞬时表达，证实AdUbox79:eGFP融合蛋白特异性定位于质膜。

3.6. AdUbox79过表达赋予烟草盐胁迫敏感性：三个独立的T1转基因株系（L3、L6、L18）在100、150和200 mM NaCl处理下，其叶面积和主根长度均比野生型（WT）显著减小，表明该基因负调控盐胁迫响应。

3.7. AdUbox79过表达加剧盐胁迫下的ROS积累：DAB和NBT染色结果显示，转基因株系在盐胁迫下积累了更多的H₂O₂和O₂^?。

3.8. AdUbox79转基因株系在离体盐胁迫下的表型和生理特征：T2代转基因株系（L3.1, L6.2, L18.3）经300 mM NaCl灌溉30天后，其根鲜重、株高、相对含水量（RWC）和叶绿素含量均低于WT，而叶片黄化更严重。转基因株系的气孔密度和面积较低，且在盐胁迫下气孔关闭能力（约16-18%）远弱于WT（35.29%）。

3.9. AdUbox79转基因株系中盐胁迫响应基因的转录调控：在转基因株系中，ABA合成关键基因NtNCED1和信号通路基因NtSnRK2.5在后期（24和72小时）表达受到抑制；而ABA非依赖性通路中的NtDREB2和NtOsmotin基因在12和72小时表达也受到抑制。NtAREB1和NtSOS1的表达无显著差异。

讨论与结论

本研究首次在美味猕猴桃cv. Hayward基因组中鉴定了88个AdUbox基因，其数量与香蕉相近，但多于葡萄、苹果等，这可能与该物种的六倍体特性及基因组复制事件有关。AdUbox蛋白C末端结构域的多样性（如ARM、WD40、TPR等）决定了其底物识别的专一性，赋予了该家族功能的复杂性。其中，AdUbox79作为拟南芥AtPUB11的直系同源物，被选为进一步研究对象。实验证明，AdUbox79在根中受盐和渗透胁迫诱导表达，其蛋白定位于质膜。在烟草中异源过表达AdUbox79导致植株对盐胁迫更敏感，表现为生长受抑、ROS积累增加、RWC和叶绿素含量降低、气孔关闭能力受损。分子水平上，AdUbox79可能通过泛素化降解某些转录因子，从而抑制了ABA依赖性和非依赖性通路中多个关键盐胁迫响应基因（如NtNCED1, NtSnRK2.5, NtDREB2, NtOsmotin）的表达。综合来看，AdUbox79在烟草中作为盐胁迫响应的负调控因子，这些结果为理解猕猴桃中泛素介导的耐盐性调控网络提供了新见解，并为未来通过基因编辑等手段改良猕猴桃的耐盐性提供了潜在的靶点。