《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide identification of
MtTCTPs and functional analysis of MtTCTP3 as a positive regulator of nodulation in
Medicago truncatula
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研究人员在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中完成翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）基因家族的全基因组鉴定，共鉴定并表征了5个MtTCTP基因。研究发现，MtTCTP
研究人员在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中完成翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）基因家族的全基因组鉴定，共鉴定并表征了5个MtTCTP基因。研究发现，MtTCTP3在结瘤过程中优先表达于根瘤顶端分生组织。沉默MtTCTP3会损害根瘤菌侵染与根瘤形成，并加速根瘤衰老；而过表达MtTCTP3则显著增强结瘤能力、固氮酶（nitrogenase）活性及植株生长。此外，蛋白质相互作用实验证实，MtTCTP3可与乙烯受体MtETR4和MtETR5发生物理互作。这些结果表明，MtTCTP3是豆科植物-根瘤菌共生结瘤的正向调控因子，并为理解TCTP蛋白参与乙烯相关调控网络、维持根瘤寿命提供了重要依据。
一、研究背景与目的
豆科植物可与固氮根瘤菌建立互利共生关系，形成特化器官——根瘤，在根瘤中大气中的氮被还原为铵供植物利用。根瘤形成需要精确协调根瘤菌侵染与根瘤器官发生两个相互依赖的过程。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）形成不定形根瘤，其顶端分生组织持续活跃，沿时空梯度形成分生区（Zone I）、侵染区（Zone II）、间区（Interzone II-III）、固氮区（Zone III）和衰老区（Zone IV）的分区结构。其中，分生区活性的维持对不定形根瘤连续生长至关重要，但其分子调控机制尚不清楚。翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）是一类高度保守的真核蛋白，参与细胞增殖、细胞周期进程、DNA修复和抗凋亡等多种过程。已有研究报道烟草NtTCTP可与乙烯受体NTHK1互作并促进受体稳定性，从而减弱乙烯敏感性；而乙烯信号在豆科植物中是结瘤的负调控因子。然而，TCTP家族在蒺藜苜蓿中尚无全基因组鉴定报道，TCTP是否参与豆科-根瘤菌共生调控、是否与乙烯受体互作仍是未知。为此，研究人员对蒺藜苜蓿MtTCTP基因家族进行了全基因组鉴定，并重点解析了MtTCTP3在结瘤和根瘤维持中的功能。
二、研究内容与总体结论
研究人员在蒺藜苜蓿基因组中鉴定出5个MtTCTP基因（MtTCTP1–MtTCTP5），通过表达谱分析发现MtTCTP2和MtTCTP5偏好表达于固氮区，MtTCTP3富集于根瘤顶端分生区，MtTCTP4主要表达于近端侵染区。由于MtTCTP3在分生区优势表达且TCTP具有促进细胞增殖的保守功能，研究人员选取MtTCTP3进行深入功能研究。通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）和过表达（overexpression, OX）实验，研究人员证实MtTCTP3正向调控根瘤菌侵染、根瘤形成、固氮酶活性及植株生长；沉默MtTCTP3引发早期根瘤衰老，过表达MtTCTP3则延缓根瘤衰老。蛋白质互作实验表明，MtTCTP3特异性地与乙烯受体MtETR4和MtETR5发生物理互作，且沉默MtTCTP3导致乙烯生物合成和信号响应相关基因表达上调。该研究将TCTP蛋白与豆科根瘤发育中的乙烯调控网络建立联系，为阐明TCTP蛋白在共生固氮中的功能提供了新视角。
三、主要关键技术方法
研究人员以蒺藜苜蓿栽培品种Jemalong A17为材料，采用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的毛状根转化体系构建转基因复合植株；根瘤菌接种使用苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021菌株。主要技术包括：利用Hidden Markov Model（HMM）搜索和保守结构域验证鉴定MtTCTP基因家族；qRT-PCR分析时空表达；启动子-β-葡萄糖醛酸酶（promoter-β-glucuronidase, GUS）融合染色检测组织定位；CaMV35S启动子驱动RNAi和过表达构建转基因根系；乙炔还原法（acetylene reduction assay, ARA）测定固氮酶活性；石蜡切片与透射电子显微镜观察根瘤显微/超微结构；双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）和酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）验证蛋白互作。每个实验均设置至少3个生物学重复。
四、主要研究结果
1. MtTCTP基因的全基因组鉴定与系统发育分析
研究人员利用TCTP结构域的Hidden Markov Model（PF00838）在蒺藜苜蓿基因组中鉴定到5个MtTCTP基因，命名为MtTCTP1–MtTCTP5。它们不均匀分布在1、2、6号染色体上，其中MtTCTP1、MtTCTP2和MtTCTP3聚在1号染色体。多序列比对显示所有成员含有保守的TCTP特征域；系统发育分析将家族分为两类：MtTCTP1/2/3与拟南芥AtTCTP2近缘，MtTCTP4/5为AtTCTP1的直系同源。
2. 保守基序与基因结构分析
5个MtTCTP蛋白均含有核心保守基序（motif 2和3），除MtTCTP1外其余4个成员具有相同的4个基序。基因结构显示各成员具有1–5个外显子和0–4个内含子，非编码区结构差异可能促进了功能分化。
3. 顺式作用元件分析
对MtTCTP基因起始密码子上游2500 bp启动子区进行分析，共鉴定到23类顺式元件，分为生长发育、激素响应、光响应和胁迫响应四类。其中MtTCTP3启动子富含乙烯响应元件（ERE）、脱落酸响应元件（ABRE）和茉莉酸甲酯响应基序，提示其可能受激素调控。
4. MtTCTP基因的表达模式
公共转录组数据显示，MtTCTP2和MtTCTP5在固氮区高表达，MtTCTP3在分生区高表达，MtTCTP4在近端侵染区偏好表达。qRT-PCR分析显示，MtTCTP2和MtTCTP3在接种根瘤菌后诱导表达，且MtTCTP3在根瘤中的表达显著高于其他组织，说明不同家族成员可能在根瘤发育中发挥分区特异功能。
5. MtTCTP3在根瘤分生组织高表达并定位于细胞核和内质网
pMtTCTP3:GUS染色显示，MtTCTP3在接种后5天的维管组织和内皮层表达，10天扩展至皮层和表皮；在根瘤原基中表达，成熟根瘤中在顶端分生区信号最强。亚细胞定位实验表明，MtTCTP3-GFP荧光与内质网标记（HDEL-mCherry）共定位，且细胞核中亦有信号，但不与质膜标记（CBL-mCherry）重叠，确定MtTCTP3定位于细胞核和内质网。
6. 抑制MtTCTP3抑制根瘤形成并引发早熟根瘤衰老
MtTCTP3-RNAi株系中MtTCTP3转录水平下降约50%，根瘤菌感染腔、表皮侵染线、皮层侵染线和根瘤原基数量均显著减少；结瘤数、固氮酶活性显著降低；共生关键基因MtNIN和MtDMI1表达下调，豆血红蛋白基因MtLb1表达也降低。组织学分析显示RNAi根瘤衰老区明显扩大，透射电镜观察到细菌和共生体大量降解；衰老相关半胱氨酸蛋白酶基因MtCP1–MtCP4表达上调。此外，MtTCTP3-RNAi植株在28天接种后生长受抑，表现为株高、根长和生物量降低。
7. 过表达MtTCTP3促进结瘤并延迟根瘤衰老
MtTCTP3-OX株系中感染事件、结瘤数和固氮酶活性均显著高于对照，MtNIN、MtDMI1和MtLb1表达上调。35 dpi时，对照根瘤已出现明显衰老区，而MtTCTP3-OX根瘤几乎无衰老迹象，固氮区维持较大。超微结构上，过表达未改变类菌体形态或密度，说明其促进效应主要来源于延长根瘤功能期和维持共生功能。
8. MtTCTP3与乙烯受体MtETR4和MtETR5互作
酵母双杂交实验表明，MtTCTP3能够与MtETR4和MtETR5发生互作，而不与其他MtETR成员互作；与MtTCTP3高度相似的MtTCTP2则检测不到与二者的相互作用。BiFC实验在烟草叶片中进一步验证了MtTCTP3与MtETR4/5的互作，荧光信号定位于细胞质和细胞核。表达分析显示MtETR4在固氮区（Zone III）表达最高，MtETR5在多个根瘤区带表达，提示MtTCTP3-MtETR5可能在分生区、MtTCTP3-MtETR4主要在固氮区发挥功能。
9. 沉默MtTCTP3改变乙烯相关基因表达
在MtTCTP3-RNAi根系中，乙烯生物合成基因（MtACO4、MtACS3、MtACS10）以及乙烯信号下游调控因子（MtEFD、MtERF73、MtERF74、MtERF75）的转录水平均显著上调，表明MtTCTP3活性降低会激活乙烯相关转录响应。
五、讨论与结论
讨论部分指出，MtTCTP家族成员在根瘤不同区带的特异性表达体现了功能分化；MtTCTP2和MtTCTP3串联排列且仅有一个氨基酸差异，但表达模式和蛋白互作对象明显不同，提示近期复制后发生了转录和功能层面分化。MtTCTP3在分生区的高表达与其促进细胞增殖的保守功能一致，RNAi和过表达实验互为印证，说明MtTCTP3在根瘤器官发生、感染进程以及成熟根瘤功能维持中均发挥正向作用。MtTCTP3的RNAi表型也可能是局部共生细胞分裂需求和整体根系生长效应共同作用的结果。乙炔还原、超微结构和衰老基因表达分析共同证明MtTCTP3抑制早熟根瘤衰老。MtTCTP3与MtETR4/MtETR5的选择性互作，以及MtTCTP3-RNAi中乙烯合成与响应基因上调，为TCTP蛋白通过乙烯信号网络调节豆科结瘤提供了可能的分子线索，尽管研究人员未直接测定乙烯产量和受体活性。研究结论为：MtTCTP3是蒺藜苜蓿共生结瘤和根瘤寿命的正向调控因子，其分生区富集表达、正反向功能表型和对衰老标志的抑制作用支持其在根瘤器官发生和功能维持中的双重作用；MtTCTP3与MtETR4/MtETR5的选择性互作以及MtTCTP3敲低后乙烯相关基因的激活，为后续解析TCTP蛋白整合到激素调控网络、调控豆科-根瘤菌共生提供了研究基础。
